Toll样受体通路激活改善呼吸道合胞病毒疫苗诱导免疫应答的研究进展

贾然，徐锦

复旦大学附属儿科医院临床检验中心，上海 201102

·综述·

Toll样受体通路激活改善呼吸道合胞病毒疫苗诱导免疫应答的研究进展

贾然，徐锦

复旦大学附属儿科医院临床检验中心，上海 201102

呼吸道合胞病毒（RSV）是导致婴幼儿严重下呼吸道感染的最重要病原体，但该病毒的灭活疫苗可引起RSV疫苗增强性疾病（RVED）。RVED的机制目前仍不清楚。Toll样受体（TLR）及其信号转导对RSV的识别和宿主免疫的激发均有重要作用，其在RVED机制中的作用也日益受到关注。本文主要介绍TLR在抗RSV天然免疫和获得性免疫中的角色及其信号通路激活状态改变对RVED免疫格局的影响，提示RVED机制可能与TLR信号通路激活不足有关，从而为RSV疫苗研制提供新的策略和方法。

呼吸道合胞病毒；疫苗增强性疾病；Toll样受体

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）属副黏病毒科肺病毒属，其基因组由编码11种蛋白的单股负链RNA组成，其中黏附蛋白（attachment protein，G蛋白）和融合蛋白（fusion protein，F蛋白）是2种能激发机体产生保护性抗体的主要跨膜糖蛋白。20世纪60年代，该病毒从2名儿童的中耳分泌物中首次分离，被认为是导致儿童（尤其是2岁以内婴儿）下呼吸道感染和住院治疗的最重要病原体，其易感人群还包括老年人和重度免疫抑制人群［1］。然而，到目前为止仍没有安全、有效的疫苗被批准用于儿童RSV感染的预防。

20世纪60年代，人们首次在婴幼儿中开展了甲醛溶液（福尔马林）灭活RSV疫苗（formalininactivated RSV vaccine，FI-RSV）的临床试验。80%的受试者在自然感染RSV后出现了比初次感染时更严重的肺炎，甚至有2名受试儿童死亡，疫苗研制失败［2］。这种接种灭活RSV疫苗导致的疾病比未接种疫苗者更严重，被称为RSV疫苗增强性疾病（RSV vaccine-enhanced disease，RVED）。几十年来，科学家一直试图解开RVED发生的秘密。初始对RVED机制的研究主要集中在体液免疫上，认为FI-RSV免疫过程中抗原表位被破坏，不能激发机体产生有效的特异性抗体。但后来关于其他疫苗的动物模型研究发现福尔马林并不是导致RVED的根源，因此对其机制的研究逐渐转移到细胞免疫上，认为RSV疫苗诱导机体产生了一个重要免疫特征——Th2型免疫应答优势［3］。这种免疫格局不仅不能有效清除RSV，还会促使各种炎性细胞、趋化因子聚集在肺部，加剧RSV感染后的免疫病理，从而导致RVED发生和发展。但灭活的RSV疫苗究竟以什么机制触发了异常T细胞免疫应答和免疫记忆的形成，仍不清楚，这也是目前RVED发生机制研究领域中的关键问题。

1 Toll样受体与宿主免疫

RSV感染人体后，首先被表达于气道上皮细胞、纤维母细胞和抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）所识别，通过一系列级联反应导致机体核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）及干扰素（interferon，IFN）调节因子家族成员活化，继而使相应的促炎因子、趋化因子和抗病毒因子〔如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和IFN〕等表达上调［4］。在RSV感染初期，促炎因子、趋化因子的增多使呼吸道黏膜中中性粒细胞及嗜酸粒细胞等聚集和活化。中性粒细胞通过释放相应的酶来清除被感染的细胞，但同时也损害周围健康组织［5］；而嗜酸粒细胞则可能与RSV感染导致的气道高反应（airway hyperresponsiveness，AHR）有关［6］。IFN包括IFN-α、IFN-β、IFN-γ，作为重要的抗病毒因子，其不仅可通过细胞自分泌或旁分泌来诱导病毒感染细胞凋亡，避免病毒侵犯周围细胞，还可从基因水平诱导产生特定产物来阻止病毒复制［6］。自然杀伤细胞（natural killer，NK细胞）和树突细胞（dendritic cell，DC）也在RSV早期感染中起重要作用。NK细胞直接杀伤病毒感染细胞，其活化后还可分泌大量IFN-γ等细胞因子来激活DC和T细胞应答，参与感染早期急性肺免疫损伤的发生［7］；DC在感染早期作为天然免疫中的哨兵细胞来识别RSV，且是连接天然免疫与获得性免疫的重要桥梁［8］。

TLR是PRR的一种，在病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）的识别中起哨兵分子的作用。TLR主要表达于包括DC、巨噬细胞及B细胞在内的APC表面。目前发现的人类TLR有10种，根据结构和功能分为5个亚家族：TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR9。其中TLR2亚家族包括TLR1、TLR2、TLR6和TLR10；TLR9亚家族包括TLR7、TLR8和TLR9；其他亚家族只有一个成员［9］。研究发现，小鼠TLR4、TLR2／6和TLR7具有免疫刺激作用；TLR3激活要迟于其他TLR，且主要起下调免疫的作用［5］。对RSV识别比较重要的TLR有TLR4、TLR3、TLR2／6、TLR7／8等。

第1个被认为与RSV识别相关的PRR是TLR4。RSV的F蛋白是最早鉴定能被TLR4识别的病毒蛋白，也是TLR2的配体。F蛋白通过与TLR4结合激发髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）转导途径，进而激活天然免疫。研究发现，F蛋白可通过与TLR4和CD14结合而促进外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）产生不平衡的细胞因子分泌，导致T细胞免疫不协调［10］。细胞内表达的TLR3对RSV的初始识别也很重要，它可识别RSV复制时产生的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）。有研究发现，TLR3与RSV感染导致的气道杯状细胞增生及黏液分泌过量有关［11］。TLR7、TLR8和TLR9位于细胞内，TLR7和TLR8识别细胞内单链RNA（single-stranded RNA，ssRNA），与RSV感染后气道黏液分泌过多有关，TLR7还与RSV感染后的免疫病理相关［12］。而TLR9识别外源DNA，包括合成的CpG寡脱氧核苷酸［13］。TLR2通常与TLR1或TLR6以异二聚体形式位于免疫细胞表面，识别外源侵入者。研究发现，TLR2和TLR6在RSV识别中起一定作用，但其是否直接与RSV作用并不清楚。TLR2和TLR6异二聚体促进RSV感染后抗病毒免疫的激发，且TLR4信号可调节TLR2信号［14］。因此，TLR作为天然免疫中识别外源侵入者的哨兵分子，对RSV早期识别和宿主免疫激发具有重要作用。

对于体液免疫，TLR信号通路的调节途径至少有2条。一条是TLR信号促进DC成熟和Th细胞活化，继而通过Th细胞与B细胞间的CD40-CD40L结合而激活B细胞应答；另一条是表达于B细胞表面的TLR直接调控B细胞应答及抗体产生。TLR信号转导途径主要有2条，一条是MyD88依赖途径，它是大多数TLR所共用的下游信号分子途径；另一条是β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TIR-domain-containing adaptor-inducing interferonβ，TRIF）依赖途径。RSV某些抗原可阻塞TLR信号通路而导致免疫逃避［15］。Schnare等发现，MyD88敲除小鼠感染病毒后不能有效激活Th细胞，其抗原特异性IgM、IgG均显著减少［16］，表明MyD88信号转导对激活T细胞和B细胞免疫有重要作用。Koyama等发现，TLR7对加强B细胞和CD4＋T细胞应答及CD8＋T细胞的分化均有重要作用［17，18］。Schulz等发现，缺乏TLR3的DC在吞噬病毒感染细胞后不能有效激发CD8＋T细胞应答，可能是TLR3的缺乏导致DC不能有效识别病毒感染细胞中的dsRNA，继而阻碍DC成熟和主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类分子的呈递，而后者导致不能有效诱导CD8＋T细胞应答［19］。另外，也有不少研究发现不同种类的TLR激动剂可激发Th1、Th17应答和保护性抗体产生［20，21］。以上研究均表明，TLR在细胞免疫和体液免疫中起重要作用。

2 TLR与RVED

TLR的信号转导对DC成熟，Th细胞、B细胞活化及保护性抗体的形成均具有重要作用，而研究发现上述指标在RVED中均减低。Delgado等用活RSV感染野生型小鼠和MyD88＋／－小鼠，发现后者产生的抗体亲和力和特异性均显著低于前者。蛋白免疫印迹结果显示，与未灭活疫苗组相比，灭活疫苗组NF-κB抑制因子α（inhibitor of NF-κBα，IκB-α）明显升高，进一步表明TLR信号转导受抑，验证了TLR信号转导在保护性抗体生成中的重要作用。另外，将灭活疫苗辅以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（TLR4激动剂）、poly（I∶C）（TLR3激动剂）和polyU（TLR7激动剂），注入小鼠体内后攻毒，发现TLR激动剂组DC的成熟度、抗体的亲和力和特异性、RSV的清除能力均比对照组显著提高，且转变为Th1型免疫应答。另外，就激发保护性抗体而言，3种激动剂的联合使用比LPS单独使用的效果更明显［20］。

单磷脂酰A（monophosphoryl lipid A，MPLA）是一种LPS来源的TLR4激动剂。Kamphuis等将MPLA包入RSV颗粒中作为疫苗，经鼻接种小鼠，发现MPLA的加入不仅能有效诱导IgG生成及Th1优势型免疫，还能诱导局部分泌型IgA生成，加强黏膜免疫。他们认为MPLA能产生这种功效的原因很可能是其与DC的TLR4相互作用［21］。纯化的F蛋白（purified fusion protein，PFP）或G蛋白（PGP）及F／G嵌合蛋白等亚单位疫苗会诱导类似FI-RSV的RVED表现，但不能产生针对RSV的保护性应答［18，22，23］。然而，de Waal等发现，将G蛋白130～230位氨基酸融合至链球菌白蛋白结合区（albumin-binding region，BB）形成一种亚单位疫苗BBG2Na，以MPLA为佐剂能有效避免RVED而诱导Th1型免疫反应［24］。Blanco等将重组F蛋白辅以MPLA或细菌样微粒（bacteriumlike particle，BLP）来免疫小鼠，发现可诱导产生强大的Th1优势型保护性应答，且不会导致肺部组织病理学改变及细胞因子风暴［25］，从而在一定程度上避免RVED。Kamphuis等也有类似发现［26］。此种现象提示，MPLA和BLP作为疫苗佐剂可诱导Th1型应答而避免RVED，这可能与其加强TLR4激活有关。

Nguyen等发现，将TLR2配体（如酵母聚糖、Pam3CSK4等）或TLR9配体（CpG）包被在RSV颗粒中经鼻接种入小鼠体内，可提高对RSV的清除能力，且能逆转白细胞介素5（interleukin 5，IL-5）／IFN-γ比例，表现为Th1型免疫应答，产生良好的黏膜免疫功效［27，28］。Garg等［29］将F蛋白与包含poly（I∶C）或CpG的三重佐剂载体（TriAdj）联合，构建出F／TriAdj疫苗，免疫后1年进行攻毒，发现小鼠产生了稳定的IgG和局部IgA分泌，且IgG的中和能力明显提高。其中F／TriAdj－poly（I∶C）疫苗比F／TriAdj-CpG疫苗在提高IgG亲和力和中和能力方面显示出更强的功效，提示这种包含TLR3或TLR9激动剂的F／TriAdj疫苗在小鼠体内接种后至少保证1年内有效。

核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2（nucleotidebinding oligomerization domain-containing protein2，NOD2）是一种细胞内PRR。Shafique等将CpG和L18-MDP（NOD2激动剂）联合使用来辅佐灭活疫苗，发现其能在体外显著激活APC系统的NF-κB分泌，激活力度随着CpG浓度升高而增强，在体内也能有效扭转偏倚的免疫应答，而不会诱导RVED［30］。Johnson等发现，接种FI-RSV时辅以CpG可显著减少嗜酸性粒细胞浸润，减轻全身性疾病情况，加用TLR7／8激动剂可协同CpG达到更佳免疫效果，但用FI-RSV单独辅以TLR7／8激动剂时并不能产生保护性免疫［31，32］。

这些研究表明，TLR2、TLR3、TLR4、TLR9激动剂可作为疫苗佐剂来诱导Th1型保护性免疫应答，从而比较全面地抑制RVED，而TLR7／8激动剂只有与其他TLR激动剂合用时才会有加强免疫的效果。

3 结语

RVED的形成涉及天然免疫和获得性免疫的整体失衡。作为激发和联系天然免疫与获得性免疫反应的纽带，TLR在RVED发生过程中起重要作用。通过加强刺激TLR及其信号通路，可有效预防RVED，这也为疫苗研制提供了新的思路和方向。

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Toll-like receptor-associated mechanism in respiratory syncytial virus vaccine-enhanced disease

JIA Ran，XU Jin
Clinical Laboratory Centre，Children’s Hospital of Fudan University，Shanghai 201102，China

Respiratory syncytial virus（RSV）is the most important pathogen responsible for children’s severe lower respiratory tract infection worldwide.However，no vaccine has been licensed to prevent RSV infection as the inactivated RSV vaccine could enhance disease severity.The exact mechanism of RSV vaccine-enhanced disease（RVED）remains unclear.Since Toll-like receptors（TLRs）and their signal pathways play crucial roles in both innate and adaptive immunity，TLR-associated RVED mechanism has been proposed and is attracting more and more attentions of researchers.In this review，we summarized the main progress on the roles of TLRs in anti-RSV immunity and their signal pathways in affecting the immune status of mice with RVED，which may enlighten the vaccine design and development.

Respiratory syncytial virus；Vaccine-enhanced disease；Toll-like receptor

.XU Jin，E-mail：jinxu＿125＠163.com

2014-12-03）

国家自然科学基金（81273204）

徐锦