CD36和胞外信号调节激酶通路在脂多糖诱导炎症因子中的作用研究

秦园，曹浚垣，吴淑燕，黄瑞

苏州大学基础医学与生物科学学院病原生物学系，苏州 215123

CD36和胞外信号调节激酶通路在脂多糖诱导炎症因子中的作用研究

秦园，曹浚垣，吴淑燕，黄瑞

苏州大学基础医学与生物科学学院病原生物学系，苏州 215123

本研究以鼠源巨噬细胞RAW264.7为模型，研究CD36和胞外信号调节激酶（ERK）通路对脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞分泌炎症因子的影响。首先用100 ng／ml LPS刺激正常及小干扰RNA（siRNA）技术沉默CD36表达的巨噬细胞16 h，检测巨噬细胞的ERK活性及分泌炎症因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）和IL-10的水平；继而以20 nmol／L ERK抑制剂处理细胞，再用LPS刺激，检测以上各项指标的变化，进一步明确ERK通路与LPS诱导巨噬细胞分泌炎症因子的相关性。结果显示，经LPS刺激，巨噬细胞的ERK活性显著增强，分泌的促炎因子TNF-α和IL-6显著增高，抑炎因子IL-10水平无明显变化；与CD36正常表达的巨噬细胞相比，CD36表达下降的巨噬细胞ERK活性及促炎因子TNF-α、IL-6水平显著下降，抑炎因子IL-10显著增多。与未处理组相比，ERK抑制剂预处理的巨噬细胞中LPS诱导的ERK活性显著降低，促炎因子TNF-α和IL-6水平降低，抑炎因子IL-10水平升高。结果提示，LPS能通过其受体——CD36，激活巨噬细胞内ERK活性，进而促进巨噬细胞促炎因子的分泌。

脂多糖；巨噬细胞；CD36；胞外信号调节激酶通路；炎症因子

超过30%的医院内感染由革兰阴性菌引起，革兰阴性菌引发的败血症和脓毒血症休克是住院患者死亡的首要原因［1］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）即革兰阴性菌内毒素，由脂质A、核心多糖和特异多糖组成。其中脂质A是主要毒性成分，且无种属特异性，因此不同细菌的LPS有相似的毒性作用，严重时威胁生命。目前认为LPS的致病机制是通过与LPS结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）及CD14分子形成LPS-LBP-CD14复合物，再与Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）及辅助受体髓样分化因子2（myeloid differential factor 2，MD-2）作用，激发细胞内信号途径，激活单核-巨噬细胞释放炎症因子，最终导致机体产生病理变化［2］。适当的炎症反应有利于机体清除细菌，但过度反应使机体遭受损伤。

巨噬细胞参与宿主抗感染免疫过程，其依赖模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）识别病原菌的病原体相关分子模式（pathogenassociated molecular pattern，PAMP），启动天然免疫，通过吞噬、消化及释放炎症因子而清除致病菌。在获得性免疫中，巨噬细胞对细菌抗原具有处理和呈递作用［3］。LPS作为革兰阴性菌的PAMP，非常保守且与致病性有关，在巨噬细胞与革兰阴性菌相互作用过程中至关重要。CD36是一种PRR，属于能识别脂类和LPS等多种配体的清道夫受体，在巨噬细胞中高表达［4］，人与小鼠间cd36基因序列高度保守［5］。研究发现，长链脂肪酸与CD36结合后，可激活下游胞外信号调节激酶（extracellular regulated kinase，ERK）通路，促发细胞核内核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）活化，促进炎症因子分泌，导致脂代谢紊乱和炎症反应，诱发心血管疾病［6，7］。CD36和ERK通路参与脂代谢有关的炎症反应屡见报道，但其在LPS诱导巨噬细胞炎症因子分泌中的作用及相关机制研究甚少。本研究应用LPS刺激小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染和ERK抑制剂干预的巨噬细胞模型，探讨CD36和ERK通路对LPS诱导炎症因子分泌的影响，为深入研究其致病机制提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及试剂鼠源巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。试剂包括LPS（Escherichia coli 0111∶B4）、CD36 siRNA与Negative control siRNA、脂质体iMax、ERK抑制剂（PD0325901）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）等。兔抗磷酸化ERK（phosphated ERK，pERK）、兔抗总ERK（total ERK，tERK）和鼠抗Tubulin购自优宁维生物技术有限公司，鼠抗GAPDH购自Bioworld Technology公司，山羊抗鼠CD36、兔二抗、鼠二抗和山羊二抗购自R＆D Systems公司，酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自eBioscience公司。

1.1.2 实验仪器CO2细胞培养箱购自Thermo公司，倒置显微镜购自Olympus公司，低温高速离心机购自Eppendorf公司，连续光谱酶标仪购自Thermo Fisher Scientific公司，PowerPac Basic电泳仪购自Bio-Rad公司，增强化学发光（enhanced chemiluminescene，ECL）全自动化学发光图像分析仪购自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染RAW264.7细胞常规培养于DMEM培养基中。siRNA序列设计参照文献［8］（表1）。转染分为2组：阴性对照组中加入脂质体iMax和Negative control siRNA复合物，CD36 siRNA转染组中加入脂质体iMax和CD36 siRNA复合物。转染前1 d，将细胞以4×105个／孔铺入12孔板，细胞融合度达60%时转染，24 h后进行后续实验［8］。

表1 siRNA序列Tab.1 The sequences of siRNA

1.2.2 MTT法检测不同浓度ERK抑制剂对细胞活性的影响将细胞以5 000个／孔接种于96孔板。将0、5、10、20、50、100 nmol／L ERK抑制剂作用于细胞，每个浓度设8个复孔。细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，参照文献［9］，用MTT法处理细胞并检测各孔540 nm和570 nm处的光密度（optical density，OD），计算平均值。细胞存活率（%）＝实验组OD540～570值／空白组OD540～570值×100%。

1.2.3 LPS与细胞共作用模型的建立首先用LPS刺激正常及转染CD36 siRNA的巨噬细胞，并设平行对照。参照文献［10］，将100 ng／ml LPS与细胞共作用16 h后收集蛋白，继而建立ERK抑制剂干预细胞模型。分组：对照组、ERK抑制剂干预组、LPS刺激组、LPS刺激＋ERK抑制剂干预组。参照预实验结果，ERK抑制剂干预浓度为20 nmol／L，作用8 h后，在LPS刺激组和LPS刺激＋ERK抑制剂干预组加入100 ng／ml LPS，继续作用16 h，收集蛋白，用以进一步明确LPS与ERK活性的相关性。

1.2.4 蛋白免疫印迹法检测巨噬细胞CD36、pERK和tERK细胞经不同条件处理、裂解，提取蛋白并测定浓度。取20μg样品进行8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），蛋白电转至硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜上。5%脱脂牛奶封闭NC膜1 h，加入兔抗pERK和tERK（1∶1 000）、鼠抗Tubulin和GAPDH（1∶1 000）、山羊抗鼠CD36（1∶1 000），4℃孵育过夜。次日用含吐温20的Tris缓冲液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）洗膜3次，加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的抗兔、抗鼠或抗山羊二抗（1∶5 000），室温孵育1 h；TBST洗膜3次，化学发光法显影，检测CD36、pERK和tERK蛋白表达。

1.2.5 ELISA检测巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素10的水平将细胞以1×106个／孔接种于6孔板中培养过夜，根据LPS与细胞共作用模型分组。①siRNA转染细胞24 h后，DMEM洗3次，所有LPS刺激组加入含100 ng／ml LPS的无血清培养基，其余组加入无血清培养基继续培养16 h。②20 nmol／L ERK抑制剂干预细胞8 h，DMEM洗3次，加入含20 nmol／L ERK抑制剂的无血清培养基，对照组加入无血清培养基；LPS刺激方法同①。收集各组培养基并用ELISA试剂盒检测肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）和IL-10水平。

1.3 数据统计

用SPSS 17.0软件进行统计学分析，多组均数两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD36对LPS激活巨噬细胞ERK活性的影响

用蛋白免疫印迹法检测巨噬细胞中CD36表达和ERK磷酸化水平，发现CD36在巨噬细胞中高表达，且LPS刺激对CD36的表达无显著影响。与无LPS刺激的阴性对照组相比，ERK磷酸化水平在LPS刺激后显著升高（P＜0.01），表明LPS能激活巨噬细胞的ERK活性（图1）。在LPS刺激条件下，经CD36 siRNA处理的巨噬细胞中CD36表达显著降低，ERK活性亦降低（P＜0.05），表明CD36表达下降可抑制LPS激活的ERK信号途径。

2.2 CD36对LPS诱导巨噬细胞分泌炎症因子的影响

用ELISA检测炎症因子的分泌水平，结果显示，单独LPS刺激组与阴性对照组相比，TNF-α和IL-6分泌水平显著升高（P＜0.01），而IL-10分泌水平无显著差异。LPS刺激＋CD36 siRNA组与单独LPS刺激组相比，TNF-α和IL-6分泌水平显著降低（P＜0.05），而IL-10分泌水平显著升高（P＜0.01）（图2）。表明LPS刺激巨噬细胞后，通过其受体CD36诱导促炎因子产生，而CD36表达下降导致促炎因子分泌水平下降；对抗炎因子的影响则与之相反。

2.3 ERK抑制剂工作浓度的确定

MTT法结果显示，随ERK抑制剂工作浓度升高，细胞存活率逐渐降低。在不高于20 nmol／L的抑制剂作用下，细胞存活率均超过50%（图3A）。结合蛋白免疫印迹结果发现，在20和50 nmol／L ERK抑制剂作用下，细胞中ERK活性最小（P＜0.01），抑制效果最好（图3B、3C）。综合上述结果，将20 nmol／L作为ERK抑制剂干预细胞的工作浓度。

图1 CD36对LPS激活巨噬细胞ERK活性的影响Fig.1 CD36 influences the activation of ERK induced by LPS

图2 CD36对LPS激活巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-10的影响Fig.2 Influence of CD36 on secretion of TNF-α，IL-6 and IL-10 measured by ELISA

图3 ERK抑制剂工作浓度的确定Fig.3 Determination of the working concentration of ERK inhibitor

2.4 ERK抑制剂对LPS诱导巨噬细胞ERK活化及分泌炎症因子的影响

LPS与ERK抑制剂干预的细胞共作用后，对细胞中ERK磷酸化水平进行检测。结果显示，与对照组相比，LPS刺激组ERK活性显著升高（P＜0.01），与LPS刺激正常巨噬细胞的结果一致。与对照组相比，ERK抑制剂干预组ERK活性显著下降（P＜0.01）。与单独LPS刺激组相比，LPS刺激＋ERK抑制剂干预组ERK活性显著下降（P＜0.01）（图4）。

检测各组炎症因子的分泌，结果显示，与对照组相比，单独LPS刺激组TNF-α和IL-6分泌水平显著升高（P＜0.01），而IL-10分泌水平差异无统计学意义。与单独LPS刺激组相比，LPS刺激＋ERK抑制剂干预组TNF-α和IL-6分泌水平显著下降（P＜0.01，P＜0.05），而IL-10分泌水平显著升高（P＜0.05）（图5）。结果表明，LPS诱导激活ERK通路，提高促炎因子分泌水平；而ERK抑制剂干预ERK通路后，LPS诱导的促炎因子分泌下降，抗炎因子分泌上升。上述结果与CD36表达下降对巨噬细胞炎症因子分泌的影响相似。

图4 ERK抑制剂对LPS激活巨噬细胞ERK活性的影响Fig.4 ERK inhibitor influences the activation of ERK induced by LPS

图5 ERK抑制剂对LPS激活巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-10的影响Fig.5 Influence of ERK inhibitor on secretion of TNF-α，IL-6 and IL-10 measured by ELISA

3 讨论

炎症反应是巨噬细胞参与宿主抗菌免疫应答的重要部分，是宿主抵抗病原体的一种保护机制。LPS能诱导巨噬细胞分泌多种炎症因子，包括TNF-α、IL-6、IL-1和IL-10等。TNF-α和IL-6是促炎因子的主要代表，TNF-α能调节炎性细胞迁移，促进其他炎症因子分泌，是造成内毒素休克及弥漫性血栓的首要因素［11］；IL-6诱导肝细胞产生急性期蛋白，与TNF-α共同介导微生物感染后宿主急性期反应，参与革兰阴性菌内毒素血症的进展［12］。IL-10作为免疫调节因子，能阻断TNF、IL-6和IL-12等炎症因子的合成和活性，具有强烈的抗炎作用，将炎症反应控制在适当范围内［13］。TNF-α、IL-6和IL-10是观察LPS诱导炎症反应的常用指标［14］。

一方面，CD36介导细胞识别革兰阴性菌和LPS等不同的配体；另一方面，CD36作为一种“生物传感器”，利用其跨膜结构将信号通过末端传导至胞质内，激活下游信号途径，在调节细胞功能方面起重要作用［15］。在神经细胞中，CD36结合β淀粉样蛋白肽，并激活下游炎症信号途径，包括Scr激酶家族蛋白、Fyn和ERK［16］。研究发现，LPS刺激过表达CD36的人胚肾细胞HEK293后，JNK信号途径激活，从而触发IL-8分泌［17］。不同细胞的CD36在介导信号转导和调节细胞功能的机制方面具有异质性［18］。本研究显示，LPS刺激正常表达CD36的巨噬细胞后，ERK通路激活，诱导分泌的促炎因子TNF-α和IL-6水平显著升高；当CD36表达下降，细胞中ERK通路受抑制，诱导分泌的促炎因子TNF-α和IL-6水平降低，而抑炎因子IL-10水平显著升高。

ERK是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族中研究最为广泛的蛋白激酶之一。ERK磷酸化后成为有活性的蛋白激酶，可调节细胞的多种功能，包括细胞增殖、分化、凋亡和衰老，还能调节炎症因子的产生和分泌［19］。在巨噬细胞中ERK通路调节TNF、IL-1β等炎症因子的产生，同时抑制IL-12、干扰素β（interferonβ，IFN-β）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等生成［20］。本研究发现，20 nmol／L ERK抑制剂阻断ERK磷酸化后，LPS刺激巨噬细胞时ERK活性被明显抑制，细胞分泌促炎因子TNF-α和IL-6的水平显著降低，而抑炎因子IL-10水平升高，此与LPS刺激CD36表达下降对巨噬细胞炎症因子分泌的影响结果一致。在单核细胞中活化的ERK能促进CD36正常表达。本研究发现，阴性对照组中低水平激活的ERK参与巨噬细胞CD36的正常表达；用CD36 siRNA阻断CD36的正常表达后，可使上游已活化的ERK累积而高于阴性对照组，其机制或与LPS刺激ERK活性升高不同，有待进一步研究。

综上所述，LPS作为PAMP存在于革兰阴性菌中，高度保守，其与巨噬细胞相互作用后，被CD36识别并通过激活ERK通路使促炎因子分泌水平升高，CD36和ERK通路参与了LPS诱发的巨噬细胞炎症因子释放，为革兰阴性菌LPS致病机制的研究提供了新的理论和实验依据。

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Effects of CD36and extracellular regulated kinase signaling pathway on inflammatory cytokines induced by lipopolysaccharide

QIN Yuan，CAO Jun-Yuan，WU Shu-Yan，HUANG Rui
Department of Microbiology，Medical College of Soochow University，Suzhou215123，China

The present paper aims to establish a RAW264.7 macrophage model to investigate the effects of CD36 and extracellular regulated kinase（ERK）signaling pathway on the secretion of inflammation-related cytokines induced by lipopolysaccharide（LPS）.Firstly，the macrophages with or without CD36 knockdown were stimulated with100 ng／ml LPS for 16 h.Then the activation of ERK and secretion of tumor necrosis factorα（TNF-α），interleukin6（IL-6）and IL-10 were analyzed.Secondly，the cells were incubated with20 nmol／L ERK inhibitor，and LPS was added for further stimulation.The changes in the above indexes were investigated.The relationship between the secretion of inflammatory cytokines and ERK signaling pathway was studied.The results showed that in normal RAW264.7 cells，LPS treatment stimulated the activation of ERK and secretion of TNF-αand IL-6 significantly，and had no significant effects on IL-10 level.CD36 knockdown inhibited the activation of ERK and secretion of TNF-αand IL-6，and increased IL-10 level upon LPS treatment.The pharmaceutical inhibition of ERK decreased TNF-αand IL-6 secretion and enhanced IL-10 secretion upon LPS treatment.The results suggest that both CD36 and ERK pathway areinvolved in LPS-mediated secretion of proinflammatory cytokines.

Lipopolysaccharide；Macrophage；CD36；Extracellular regulated kinase signaling pathway；Inflammatory cytokine

.HUANG Rui，E-mail：hruisdm＠163.com

2015－05－06）

国家自然科学基金（81471572）

黄瑞