急性热应激对鹅血清激素水平及肝脏HSP70 基因表达的影响

仲庆振，王 丹，孙泽威，娄玉杰

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118）

作为动物应激反应的主要调控物质，促肾上腺皮质激素、肾上腺皮质激素、甲状腺素、胰高血糖素、生长激素等被称为“应激激素”，并被作为评价机体应激反应强度的客观指标[1]。热应激蛋白70（Heat stress proteins 70，HSP70），可调节细胞的生理功能，提高细胞对应激源的耐受性[2]。因此，在受到应激刺激时，细胞能否适时产生足量的HSP70 是细胞功能状态和抗应激能力良好的重要生物学标志[3]。

本试验通过放射免疫和实时荧光定量PCR 技术，测定鹅不同时间急性热应激处理血清激素水平和肝脏HSP70 mRNA的表达变化，揭示鹅在急性热处理下鹅应激指示激素和肝脏HSP70 mRNA的动态变化规律，为判断鹅的热应激状态和研究鹅的耐热机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计 选取1 日龄健康仔鹅60 只，随机分成6 组，每组10 只，单笼饲养在环控仓内，自由采食及饮水。随着日龄的增长，逐渐将环境温度下调至（22±1）℃。待饲养至8 周龄时，对照组仍置于（22±1）℃环境中，其余各组鹅突然施于2、4、6、8 h 和10 h（40±1）℃（相对湿度65%）的高温处理，各组处理均在16：00 结束。

1.2 样品采集 处理结束后，试验鹅全部屠宰取全血，室温静置30 min，3 500 r/min 离心10 min 分离血清，-20 ℃保存、待测；取100 mg 左右肝脏迅速投入液氮速冻后置-80 ℃保存待测。

1.3 激素测定 INS、COR、T3、T4的含量采用放射免疫分析法，按试剂盒的说明书进行测定，γ放射免疫计数器为中国科大中佳公司GC-2016 型。

1.4 肝脏HSP70 mRNA测定

1.4.1 总RNA的提取及反转录 利用TRIZol 试剂盒提取总RNA后，使用SYBR ExScriptTMRTPCR Kit（宝生物工程（大连）有限公司）试剂盒进行反转录合成cDNA，-20 ℃保存。

1.4.2 引物设计 根据GenBank发表的鹅HSP70基因序列（序列号：EU680475）和GAPDH 基因序列（序列号：DQ821717），利用Primer Premier 5.0软件设计两对引物，HSP70 F：5′-GGAGACAAGTCCGAGAAT-3′，HSP70 R：5′-GGAGGGATGCCTGTTAGA-3′；GAPDHF：5′-GGTGGTGCTAAGCGTGTCAT-3′，GAPDH-R：5′-CCCTCCACAATGCCAAAGTT-3′。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4.3 实时荧光定量PCR 检测 荧光实时定量PCR在美国产ABI7000 荧光定量分析仪上进行。PCR 反应体系为20 μL，反应液配比为：cDNA模板1.0 μL，上游引物、下游引物各0.4 μL，PremixEx Taq10 μL，灭菌蒸馏水7.8 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL。反应条件是：95 ℃预变性30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 个循环。所有样品检测均设1 个平行样和1 个无模板的阴性对照以排除假阳性结果。获得HSP70 标准方程为：Y=-3.5846Log（X）+27.2794，相关系数为R2=0.9693；内参GAPDH 标准方程为：Y=-3.5086Log（X）+23.8604，相关系数为R2=0.9679。△Ct（CtHsp70-CtGAPDH）与模板倍比稀释浓度的线性方程为：Y=0.018X+3.406，斜率接近0，说明HSP70 mRNA和内参GAPDH 具有相似的扩增效率，可以应用2-△△Ct法对测定结果进行计算分析。

1.5 统计分析 对试验所获得数据采用SPSS13.0统计软件进行单因子方差分析和duncan′s 多重比较，数值以±SD的形式表示。

2 结果

2.1 急性热应激对仔鹅血清几种激素水平的影响 如表1 所示，2 h 热应激处理并未对血清INS水平造成显著影响；从热应激4 h 开始，鹅血清INS水平显著下降（P＜0.05），此后随热应激时间延长未再出现显著变化。仔鹅血清COR 浓度从热应激4 h 后开始显著性升高（P＜0.05），但热应激处理4、6、8 h 和10 h 之间无显著差异。仔鹅血清T3浓度在热应激处理2 h 以后极显著下降（P＜0.01），热应激6 h 和8 h 后降至最低水平。血清T4水平在热应激2 h 后便显著下降，但到热应激10 h后又恢复到对照组水平。

表1 急性热应激条件下仔鹅的血清激素水平

2.2 急性热应激对仔鹅肝脏HSP70 mRNA水平的影响 如图1 所示，仔鹅肝脏HSP70 mRNA水平从热应激2 h 后便开始显著升高，其中热应激2、8 h 和10 h 处理组HSP 70 mRNA表达水平相近，均显著低于热应激4 h 和6 h 组，上述差异均达到了统计学极显著水平（P＜0.01）。

图1 H SP70mR NA在热应激处理仔鹅肝脏内的表达水平

3 讨论

3.1 急性热应激对鹅血清激素水平的影响 热应激状态下，交感神经兴奋，肾上腺素和去甲肾上腺素分泌增多，进而抑制胰岛素的分泌[4]。本试验研究结果证实了这一论点，急性热应激4 h 可显著降低仔鹅血清INS水平，但此后再进一步延长热应激时间并未引起INS水平进一步降低。肉鸡热应激方面的研究也得出了相似结论，在短期热应激过程中胰岛素下降，而在长期应激过程中胰岛素水平呈无规律变化[5]。许多研究结果表明，热应激可显著提高动物机体COR 水平[6]。本试验得出相同结论，仔鹅血清COR 浓度在热应激4 h 开始显著升高，但随时间推移，皮质醇含量没有进一步提高。由于本试验仅进行10 h 急性热应激处理，10 h 后鹅血清COR的变化需进一步研究证实。

高温环境中，鸡通过减少甲状腺激素分泌降低自身代谢产热[7]。T3浓度在热应激条件下会迅速下降，为肉鸡热应激敏感指标；T4受热应激后也下降，但反应较T3迟缓，可作为热应激的参考指标[8-9]。本研究中，仔鹅甲状腺功能对热应激也表现出了较高的敏感性，T3、T4水平均在热应激2 h 后便显著下降，进而降低代谢水平，减少体产热以维持体热平衡。但也有研究提出了相反的结论[10]。

3.2 急性热应激对仔鹅肝脏HSP70 mRNA水平的影响 本试验热应激处理2 h，仔鹅肝脏HSP70 mRNA表达量极显著升高，比应激前上升3.57 倍，与许友生（2011）[11]研究结果一致。而王德前（2012）[12]认为，热应激对蛋鸭肝脏中HSP70 mRNA的表达量没有影响。这可能与动物品种、热应激的强度和时间等因素有关。同时本试验发现，肝脏HSP70 mRNA水平6 h 升至最高点，8、10 h 低于6 h 水平，这可能因为HSP70 的表达受到负反馈调控，即高含量的HSP70与HSF结合并抑制HSF的活性，从而减少HSF和HSE的特异性结合，控制热休克基因的进一步转录，也可能由于机体进行自我保护性的调节反应，使机体逐步适应了环境的变化。

4 结论

（40±1）℃不同时间长度的急性热应激处理导致仔鹅生理机能的显著变化，血清COR含量显著上升，INS、T3、T4含量显著下降；热应激下HSP70 基因的表达受热应激调节，诱导表达的HSP70 使机体获得了一定的高温耐受力，对应激起到一定的保护作用。

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