新疆石河子地区汉族人群HLA-DPB1 基因多态性与肺结核易感的相关性研究①

卢丽君 吴江东 左维泽 张万江 章 乐 吴 芳

(石河子大学新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室，石河子 832000)

肺结核是本世纪威胁人类健康的主要传染病，全球有约1/3 的人感染结核分枝杆菌，在不发达和发展中国家尤为严重，国内形势也不容乐观。全国第5 次结核病流行病学抽样调查显示我国活动性肺结核患病率459/10 万［1］。所感染人群，约10%的人可发展成活动性肺结核，提示可能有相关基因参与疾病的发生发展。近年来，国内外已有大量研究显示肺结核与白细胞分化抗原(HLA)Ⅱ类基因密切相关。

HLA 位于人类第六号染色体的短臂，长约3 600 kb，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类，其中HLA Ⅱ类可分为HLA-DR、HLA-DQ 和HLA-DP 区，HLA-DQ 和HLA-DR 基因与肺结核的相关性国内外学者已进行了广泛研究，而HLA-DP 也开始受到关注。1978 年Wank 等预处理淋巴细胞分型(Primed lymphocyte typing，PLT)时发现DR、DQ 不一样的新抗原，使预处理T 淋巴细胞产生很强的二次反应，导致后来HLA-DP 抗原的发现。到目前为止IMGT/HLA 数据库经WHO 确认报道的HLA-DPB1 等位基因已有489 个(http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/docs/release.html，2015，2.5)。HLA-DP 是表达于B 细胞、抗原提呈细胞和激活的T 细胞表面的糖蛋白。DP 分子是异二聚体，由一条α 链和β 链组成，后者具有高度多态性。迄今为止，国外仅有印度南部研究显示HLA-DPB1* 04 与肺结核密切相关，具有预防及保护性作用［2，3］，国内暂无HLA-DPB1 与肺结核相关性的研究。为此，本研究采用SBT 方法从群体遗传学及分子遗传学角度分析新疆石河子地区汉族肺结核患者与HLA-DPB1 等位基因的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 病例组为2014 年3 月至2014 年9 月石河子大学医学院第一附属医院感染科门诊和住院部的肺结核患者，共93 例，均符合肺结核的诊断标准。收集其相关资料并与其签署知情同意书。其中男58 例，女35 例;年龄16～85 岁，平均(46.1±13.5)岁。健康对照组为肺结核患者周围环境同时期进行健康体检的人群。共96 例，已排除其他各类慢性疾病，其中男70 例，女26 例;年龄20～78岁，平均(41.3 ±10.6)岁。对照组与病例组按性别和年龄(±5 岁)配比选取，两组间性别、年龄差异均无统计学意义(P ＞0.05)。所选研究对象在新疆生活均超过20 年，祖籍以河南(27.3%)、甘肃(21.5%)、陕西(12.0%)和山东(10.8%)为主，个体之间无血缘关系。

1.2 方法 DNA 的提取:抽取病例组和对照组人群外周静脉血3 ml，EDTA 抗凝，用天根公司DNA提取试剂盒(the mini column whole blood DNA extraction kit from tiangen)提取基因组DNA 。用紫外分光光度计测定DNA 浓度和纯度，根据A260/A280 值计算DNA 提取的纯度。

HLA-DPB1 等位基因检测:HLA-DPB1 基因分型采用美国Invitrogen 公司(美国life technologiest公司产品)SeCoreTMHLA 测序试剂盒［5351925，SeCore DPB1 Locus Sequencing Kit，Group Specific Set(RUO)］，其中HLA-DPB1 基因检测2 号外显子正向反向测序。操作步骤:首先PCR 扩增、产物经酶切纯化后作为测序反应模版，按照试剂盒操作进行测序反应利用ABI 3730 DNA 测序仪进行电泳分析。采用uTYPE Dx 序列分析软件指定型别。样本分型均在国家认证实验室采用标准化分型方法，操作依据国际认证试剂盒按照说明书，经专业人员进行分型分析，实验中采用双盲对照方法，随机重复实验样本，来检查实验的准确性。

1.3 统计学方法 采用Arlequin3.5 检验分析Hardy-Weinberg 平衡。采用SPSS17.0 以χ2检验比较各等位基因频率在不同组之间的差异，对于频数小于5 的采用fisher 确切指定方法计算。以比值比(OR)及其95%可信区间(CI)表示各等位基因携带个体发生肺结核的风险度。所有统计检验均为双侧概率检验。以P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例组与对照组等位基因分布情况及Hardy-Weinberg 平衡检验 自93 例新疆石河子地区汉族肺结核患者和96 例新疆石河子地区汉族健康对照个体的HLA-DPB1 基因外显子二核酸序列通过与HLA-DPB1 基因型数据库比较分析，共检出有16 种HLA-DPB1 等位基因型别。其中以DPB1* 0501 等位基因的频率最高。病例组占38.2%，对照组占28.1%。其次为DPB1* 0201(16.7%;27.6%)。另一个频率较高的等位基因为DPB1 * 0401(17.1%;15.1%)，在新疆汉族人群中这三个基因超过DPB1 等位基因的70%。其余基因频率为0.5%～5.0%，其中对照组中有四个等位基因在病例组中未检出来，详见表2。病例组和对照组的HLA-DPB1等位基因频率符合Hardy-Weinberg平衡，见表1。

表1 病例组和对照组HLA-DPB1 的Hardy-Weinberg 平衡检验Tab.1 Hardy-Weinberg equilibrium for HLA-DPB1 in patients and controls

表2 在肺结核病例组和健康对照组中HLA-DPB1 等位基因的频率Tab.2 Frequencies of HLA-DPB1 alleles in patients and controls

2.2 病例组与对照组基因频率对比及差异性比较在新疆石河子地区汉族肺结核患者与新疆石河子地区汉族健康对照组中的HLA-DPB1 等位基因频率见表2。可观察出对照组中HLA-DPB1* 0201 等位基因频率明显高于病例组(27.6% vs 16.7%，OR=0.525，P=0.011);而HLA-DPB1* 0501 在病例组的频率显著高于对照组(38.2% vs 28.1%，OR=1.578，P=0.038)。检出的其余等位基因在病例组与对照组中频率分布无显著统计学差异。

3 讨论

HLA 基因在机体免疫调节中作用重大，尤其是HLA-Ⅱ类分子是在T 细胞介导的细胞免疫中所必需的分子，它主要参与了抗原肽的特异结合，并将之呈递给CD4+T 细胞，形成MHC-抗原-T 细胞复合物，进而引起机体免疫反应。由于它在免疫反应中的重要性和自身的高度多态性，HLA 基因在疾病相关性研究中日益受到重视，尤其是HLA-Ⅱ类基因。已有研究发现HLA 系统与500 余种疾病的发生、发展有关，并且在器官移植中应用广泛。

近20 年来，国内外已对多个种族和地区的人群HLA-Ⅱ类等位基因频率进行了群体遗传学分析，并在此基础上研究HLA 基因型别与疾病的关联，获得了很多有意义的资料。

在中华人民共和国建国前，新疆长期居住的汉族人群极少，自解放来，响应党中央“建设大西北”号召，来自五湖四海的汉族人群构成了新疆汉族人群的基础，而石河子地区位属北疆，又是兵团城市，汉族人群居多，依据我们采集样本数据分析，此地区汉族人群祖籍多以河南、甘肃、陕西、山东等地为主。由于长期受新疆独特的气候、地理环境、生活方式等影响，为了适应环境，新疆汉族人群经过几十年的融合变迁，HLA-DPB1 等位基因有了频率分布的自身特点，但仍然偏北方人群。

本研究对照组数据显示HLA-DPB1* 0501(28.1%)、HLA-DPB1* 0201(27.6%)、HLA-DPB1*0401(15.1%)是新疆石河子地区汉族人群的高频基因，之前有文献报道我国其他地区汉族人群HLADPB1 频率分布情况，关于新疆汉族人群却未见报道，依据HLA 频率分布趋势，我国汉族人群可分为南北两大群体。北方地区(如沈阳、山东35%左右)HLA-DPB1* 0501 频率普遍低于南方地区(如四川、浙江、广东40%左右)，呈北低南高的趋势;而HLADPB1* 0201 的频率则是北方(如沈阳、山东20%左右)高于南方(如浙江、四川、广东15%左右)，呈北高南低的趋势，HLA-DPB1* 0401 及其他基因无明显分布规律［4-7］。新疆哈萨克族与维吾尔族人群的HLA-DPB1 基因与新疆汉族人群相比较，HLA-DPB1* 0401 所占比例最大(哈萨克族21.4%;维吾尔族31.6%)，而HLA-DPB1* 0501 比例却明显降低(哈萨克族20.2%;维吾尔族7.0%)［8，9］。亚洲其他国家(如韩国、日本)人群HLA-DPB1 基因与中国新疆汉族相比较，前三位HLA-DPB1* 0501、0201、0401所占比例大体一致，HLA-DPB1* 0402 基因在中国汉族所占比例很小，基本在10%以下，而在韩国、日本却占10%以上［10，11］。本研究所选研究对象皆是在新疆石河子生活超过20 年的汉族人群，具有一定的代表性，本研究可为新疆本地汉族的人类学及疾病相关性研究提供依据和参考。

HLA-Ⅱ类分子主要参与外源性抗原的传递，是与结核分枝杆菌相关性最高的一类分子，但结核病的发病机制尚不十分清楚，大量的研究证实肺结核与遗传和环境因素密切相关，是遗传与环境相互作用的结果［12-14］。因此对HLA 进行分型并分析其与肺结核的相关性已研究甚广。HLA 分型方法早期主要基于血清学和细胞学的方法，该法分辨率低、成本高。目前已被DNA 为基础的分型方法取代:顺序特异性引物法(Sequence specific oligonucleotide probe，SSP)，该法以少量样本检测、低分辨率为主;顺序特异性寡核苷酸探针法(Sequence specific oligotide，SSOP)则适合高通量、中分辨率样本检测;近些年使用的基于测序的分型方法(Sequence-based typing，SBT)，是目前HLA 分型检测公认的金标准，具有高通量、高分辨率的特点。基于这个特点，本研究采用目前分辨率最高的基因型分型方法—SBT 方法分析HLA-DPB1 基因与肺结核的相关性，该分型方法可保证本研究中等位基因分型的可信度和特异性。HLA-Ⅱ类基因与结核的研究多限于HLADRB1 与HLA-DQB1，对于HLA-DPB1 与结核的研究国外研究非常有限，仅限于印度［2，3］，国内暂无其与肺结核的研究，HLA-DPB1 分子与HLA-DRB1 和HLA-DQB1 非常相似，都参与抗原提呈给T 细胞并诱导二次增殖反应。但是HLA-DPB1 与其他疾病的研究国内外较多，例如研究显示HLA-DPB1* 0501可能为类风湿关节炎的保护基因［15］;HLA-DPB1*0402 可能为阵发性睡眠和I 型糖尿病的保护基因［16-18］;HLA-DPB1* 0201 可能为哮喘的保护性因素［19，20］，HLA-DPB1* 0301 与阿司匹林不耐受哮喘的易感强相关［21］。可看出HLA-DPB1 在疾病中倾向于明显的保护作用。本研究对照组中HLA-DPB1* 0201 等位基因频率明显高于病例组(OR=0.525，P=0.011)，可以认为HLA-DPB1* 0201 可能是肺结核的保护基因，统计学差异显著。而HLADPB1* 0501 在病例组的频率显著高于对照组(OR=1.578，P=0.038)，则认为HLA-DPB1* 0501 可能为肺结核的易感基因，但由于此P 值接近0.05，不排除因为样本量小而产生的偏倚和误差或因HLA-DPB1 等位基因与其他基因座位的连锁作用，所以HLA-DPB1*0501 为肺结核的易感基因的可信度相对较低，需加大样本量、进一步分析其单倍型验证。

近几十年在不同地域、人群、种族之间进行了很多HLA-Ⅱ类基因与肺结核的研究，但结果不太一致，甚至自相矛盾，可能除了与技术手段有限和样本量低有关外，还可能与多个基因表达同一种特定肽有关，而这个肽与疾病易感的重要性可能远远超过基因本身。因此，需在发现相关易感基因基础上进一步做功能学验证。

本研究的结果是初步的，受研究样本小和HLADPB1 与相关HLA-Ⅱ类基因连锁的作用的影响，今后还需进一步扩大样本量，结合家系调查，从HLADPB1 单倍型及与其他基因连锁不平衡分型等方面进行分析验证。从基因水平上研究有利于了解肺结核的发病机制，为新型抗结核疫苗的开发、疾病有效防治策略及新疆石河子地区汉族人群肺结核个体化治疗提供有益的参考。

［1］王 宇.全国第五次结核病流行病学抽样调查资料汇编［M］.北京:军事医学科学出版社，2011:1-5

［2］M.Ravikumar VD，K.Rajaram，et al.Associations of HLA-DRB1，DQB1 and DPB1 alleles with pulmonary tuberculosis in south India［J］.Tubercle and Lung Disease.1999，79(5):309-317.

［3］Selvaraj P，Raghavan S，Swaminathan Sea.HLA-DQB1 and -DPB1 allele profile in HIV infected patients with and without pulmonary tuberculosis of south India［J］.Infect Genot Evol，2008，8(5):664-671.

［4］Zhou L，Lin B，Xie Y，et al.Polymorphism of human leukocyte antigen-DRB1，-DQB1，and-DPB1 genes of Shandong Han population in China［J］.Tissue Antigens，2005，66(1):37-43.

［5］于桂兰，孙逸平.沈阳汉族人群HLA-DR，DQ，DP 的DNA 分型研究［J］.中国免疫学杂志，1995，11(3):142-145.

［6］王春艳，王 钰，欧国进，等.四川汉族HLA_DPB1 等位基因多态性研究［J］.中国输血杂志，2014，27(1):6.

［7］孙筱放，黎 青.中国广东汉族群体HLAⅡ类基因多态性的研究［J］.中华医学遗传学杂志，1997，14(5):270-273.

［8］Mizuki N，Ohno S，Ando H，et al.Major histocompatibility complex class II alleles in Kazak and Han populations in the Silk Route of northwestern China［J］.Tissue Antigens，1997，50(5):527-534.

［9］Mizuki N，Ohno S，Ando H，et al.Major histocompatibility complex class II alleles in an Uygur population in the Silk Route of Northwest China［J］.Tissue Antigens，1998，51(3):287-92.

［10］Song E Y，Park M H，Kang S J，et al.HLA class II allele and haplotype frequencies in Koreans based on 107 families［J］.Tissue Antigens，2002，59(6):475-486.

［11］Geng L，Imanishi T，Tokunaga K，et al.Determination of HLA class II alleles by genotyping in a Manchu population in the northern part of China and its relationship with Han and Japanese populations［J］.Tissue Antigens，1995，46(2):111-116.

［12］Mller M，Hoal EG.Current findings，challenges and novel approaches in human genetic susceptibility to tuberculosis［J］.Tuberculosis.2010，90 (2):71-83.

［13］Dolin PJ，Raviglione MC，Kochi A.Global tuberculosis incidence and mortality during 1990-2000［J］.Bulletin of the World Health Organization，1994，72 (2):213-220.

［14］Murray CJ，Styblo K，Rouillon A.Tuberculosis in developing countries:Burden，intervention and cost［J］.Bull Int Union Tuberc Lung Dis.1990，65 (1):6-24.

［15］朱乃硕，王福庆，陈诗书，等.上海地区汉族正常人及类风湿关节炎病人HLA-DPB1 基因多态性分析［J］.中国免疫学杂志，2000，16(4):196-197.

［16］Ollila HM，Ravel JM，Han F，et al.HLA-DPB1 and HLA Class I Confer Risk of and Protection from Narcolepsy［J］.The American J Human Genetics，2015，96(1):136-146.

［17］Stuchlikova M，Kantarova D，Michalkova D，et al.Association of HLA-DPB1 alleles with type I diabetes mellitus in Slovak population［J］.Bratisl Lek Listy，2006，107(3):73.

［18］邢万佳，克丙申.1 型糖尿病HLA-DPB1，DQB1 基因与其自身抗体相关性研究［J］.中华内分泌代谢杂志，2001，17(6):338-340.

［19］邬于川，刘春华，范冬梅，等.HLA-DPB1 等位基因与四川汉族人哮喘的相关性研究［J］.中国临床医学，2007，14(2):162-164.

［20］陈丽萍，薛 红，李景姝，等.支气管哮喘与HLA-DPB1 基因相关性的研究［J］.沈阳医学院学报，2012，14(1):14-16.

［21］Choi JH，Lee KW，Oh HB，et al.HLa association in aspirin-intolerant asthma:DPB1 0301 as a strong marker in a Korean population［J］.J Allergy Clin Immunol，2004，113(3):562-564.