C3a、C5a 受体缺失减轻IgA 肾病肾损伤①

晏现丽 张 颖 郑立运 任凌燕 周雅丽 权松霞 邢国兰

(郑州大学第一附属医院肾内科，郑州 450052)

IgA 肾病为亚太地区最常见的原发性肾小球疾病［1］，对该病发病机制的探究虽历经了近半个世纪，但目前发病机制仍不明确。既往研究多聚焦于IgA 分子的异常糖基化，然而IgA 分子的异常并非IgA 肾病唯一及主要发病机制［2］。有文献报道补体可能是参与IgA 肾病发病的关键因素［3］。我课题组前期临床研究中已发现C3a、C5a 在IgA 肾病病理损伤中发挥重要作用［4］，本研究旨在进一步探讨C3a、C5a 在IgA 肾病发病中作用的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 6～8 周龄BALB/c 雌性小鼠28 只，SPF 级，体重18～23 g，7 只/组，其中野生型及阴性对照组购自郑州大学动物实验中心，C3a受体敲除组及C5a 受体敲除组小鼠通过南京大学南京生物医药研究院代购于美国Jackson 实验室。仙台病毒由中国科学院武汉病毒研究所惠赠，9 日龄SPF 级活鸡胚购于北京梅里业维通实验技术有限公司。

1.2 仙台病毒的扩增及血凝价测定 0.2 ml 仙台病毒浓缩液中加入1 ml 无菌生理盐水稀释后混匀，取0.15 ml 稀释液接种于鸡胚尿囊腔，接种后鸡胚置于37℃恒温箱中孵育，24 h 后观察鸡胚生长情况，活鸡胚继续孵育28 h 后取出置于4℃冰箱中过夜，次日吸取尿囊液3 000 r/min，4℃离心25 min，吸取上清。所获病毒液参照以往方法［5］测定血凝价。

1.3 小鼠IgA 肾病模型建立 小鼠置于河南省医药科学研究院动物实验室IVC 系统中适应性饲养3天，开始给予有活性病毒滴鼻，1 次/周，持续14 周(病毒量:第1、2 次2.5 ×104，第3 次2.5 ×105，第4次2.4 ×106，第5 至14 次均为1.92 ×108)，第6 及14 次同时给予含有6.25 ×108个病毒粒子混悬液尾静脉注射;阴性对照组与实验组同时间给予等量PBS 液;实验期间所有小鼠自由采食、饮水。

1.4 生化指标测定 分别于实验前及第15 周末于代谢笼中收集24 h 尿，采用CS400 自动生化仪检测24 h 尿蛋白量。实验前一天采用毛细管通过眼球后静脉取血，0.2～0.3 ml/只;实验结束后10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠(0.1 ml/25 g)，摘取眼球取血，0.8～1.2 ml/只，所取血液于4℃冰箱静置2 h，3 000 r/min，4℃离心10 min，取上清，采用CS400 自动生化仪检测血清尿素氮、肌酐值。

1.5 肾脏组织病理学检查 10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠(0.1 ml/25 g)，沿腹中线剖开腹腔，取出肾脏，剥离肾包膜，沿矢状面剖开肾脏，再沿横断面切开肾脏，冰生理盐水冲洗，取1/4 肾脏置于4%中性甲醛中固定，4℃过夜后石蜡包埋，制成3 μm 厚切片，经苏木素-伊红(HE)染色、过碘酸-希夫(PAS)染色、马松三色(Masson)染色，光学显微镜观察肾小球病理改变即免疫复合物沉积情况。取部分肾皮质包裹于湿生理盐水纱布中，OCT 包埋后制成4 μm厚冰冻切片，室温下凉片20 min，滴加异硫氰酸(FITC)标记的IgA 抗体(STAR137F AbD Serotec)及C3 抗体(sc-58926 Santa Cruz)，采用直接免疫荧光法检测肾脏中IgA、C3 沉积情况。

1.6 肾组织中IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α、TGF-β mRNA 的实时荧光定量PCR 检测 Trizol 法提取肾组织总RNA，测A(260nm)/A(280nm)值为1.8～2.0，凝胶电泳检测所提取RNA 的完整性。按照反转录试剂盒(SK2425 上海生工)反转录为cDNA 后进行荧光定量PCR 反应。实时荧光定量PCR 引物见表1。反应体系20 μl:SybrGreen qPCR Maste Mix 10 μl，PCR 上、下游引物各1.0 μl，灭菌蒸馏水6.0 μl，cDNA 模板2.0 μl。反应条件:第1 阶段，预变性95℃3 min;第2 阶段，PCR 反应(95℃15 s，60℃40 s)40 个循环;第3 阶段，95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s;得到每个样品的Ct 值。采用2-ΔCt计算目的基因相对表达量，采用GAPDH 作为内参基因。

1.7 统计学处理 采用SPSS17.0 进行统计分析，计量资料用±s 表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni 法，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

表1 实时荧光定量PCR 引物Tab.1 Primers of RT-qPCR

2 结果

2.1 一般情况 实验过程中四组小鼠均无死亡，实验组小鼠在第4 次给予病毒后出现活动减少，体重下降，部分小鼠喜蜷缩，毛发无光泽，实验过程中所有小鼠无鼻腔脓性分泌物及肉眼血尿。

2.2 各组24 h 尿蛋白量及肾功能比较 建模后实验组与阴性对照组比较尿蛋白量差异有统计学意义;C3a 受体敲除组、C5a 受体敲除组与野生型组比较尿蛋白量差异有统计学意义;四组之间血清肌酐及尿素氮及血清肌酐差异无统计学意义，见表2。

2.3 各组小鼠肾组织免疫荧光沉积强度 实验组小鼠肾小球有较强IgA沿肾小球系膜区沉积，且野生型组荧光沉积强于其他两组，阴性对照组则无IgA 沉积;C3 沉积情况同IgA，见图1。

2.4 各组小鼠肾脏组织病理改变 实验组小鼠肾组织均有不同程度的系膜细胞增生及系膜基质增多，部分伴有间质灶状炎性细胞浸润及小血管内皮细胞肿胀;系膜区可见嗜复红蛋白沉积;且野生型组病理改变较C3a 受体敲除组及C5a 受体敲除组明显;阴性对照组未见上述病理改变，见图2 。

图1 各组小鼠肾脏组织荧光沉积(×400)Fig.1 Deposition of IgA and C3 in glomerulus of four groups(×400)

图2 各组小鼠肾脏组织病理改变(PAS 染色，×400)Fig.2 Renal pathology of four groups (PAS，×400)

表2 各组小鼠血清肌酐、尿素氮及24 h 尿蛋白量比较Tab.2 Serum blood urea nitrogen(BUN)and creatinine(Cr)and 24 hours urine total protein(UTP)of different groups at weeks 0 and 14

图3 各组小鼠肾脏组织炎症因子及细胞因子mRNA 相对表达量Fig.3 Relative mRNA expression of inflammatory factors and cytokines in renal tissue

2.5 各组小鼠肾脏组织中TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-6、MCP-1mRNA 相对表达量比较 实验组小鼠肾组织炎症因子及细胞因子mRNA 相对表达量高于阴性对照组，同时野生型组高于C5a 受体敲除组及C3a 受体敲除组，另外IL-1β、IL-6、MCP-1 的mRNA相对表达量C5a 受体敲除组高于C3a 受体敲除组，差异具有统计学意义，见图3。

3 讨论

IgA 肾病1968 年由学者Berger 等提出，虽已历经近半个世纪，但其发病机制仍不明确。本研究参照学者Emancipator 等［6，7］所采用方法建立小鼠IgA肾病模型，在此基础上探究C3a、C5a 及其受体在IgA 肾病发病中的作用及其潜在机制。

有文献证实补体旁路途径及甘露糖结合凝集素途径参与IgA 肾病发病，而C3a、C5a 是补体活化过程中所产生的主要致炎产物，有文献报道［8-10］C3a、C5a 参与了缺血再灌注肾损伤、过敏性哮喘、糖尿病肾病等疾病发病，然而其在IgA 肾病中作用报道较少。余学清等［11］发现编码补体调节因子H 因子及其受体的基因异常与IgA 肾病发病相关。我课题组［4］在前期的临床回顾分析中也发现肾脏局部C3a、C5a 沉积强度及C3a 受体、C5a 受体表达强度与肾脏病理改变严重程度正相关。本研究中也发现C3a 受体敲除及C5a 受体敲除组小鼠在蛋白尿量、肾脏组织病理改变上均轻于野生型组。

C3a 受体及C5a 受体缺失主要通过阻止C3a 及C5a 与其结合减少炎症因子及趋化因子分泌减轻肾脏损伤，其中C3a 受体缺失在减轻肾损伤方面发挥更强作用。Bao 等［12］发现C3a、C5a 在补体介导的肾小管肾间质损伤中发挥不同作用，C3a 受体缺失在减少肾小管间质中T 淋巴细胞及单核巨噬细胞浸润的作用较C5a 受体缺失更显著;Engelke 等［9］也发现C3a 受体缺失与C5a 受体缺失相比减少IL-1β 分泌的作用更强。我课题组［4］的前期研究中也发现肾脏局部C3a 受体表达阳性率与IgA 肾病24 h尿蛋白量及肾脏病理级别的相关性比C5aR 显著。本研究中也发现C3a 受体缺失组小鼠肾组织IL-1β、IL-6、MCP-1 mRNA 相对表达量低于C5a 受体缺失组，由于IL-1β、IL-6、MCP-1 主要由单核/巨噬细胞、T 淋巴细胞分泌［13］，既往研究又表明C3a 在趋化T 细胞及单核/巨噬细胞方面作用强于C5a，有意思的是本研究中并未发现C3a 受体敲除组与C5a受体敲除组小鼠在24 h 蛋白尿及肾脏病理改变上存在差异，这可能与本研究中所采用模型IgA 肾病病理改变本身较轻微，未见明显肾小球硬化及肾小管间质病变等较重病理改变，再者，本研究所采用小鼠为C3a/C5a 受体单敲，敲除一种补体片段受体情况下不能完全排除另一种补体作用的干扰。

综上所述，C3a、C5a 均参与IgA 肾病发病，C3a受体及C5a 受体缺失可减轻IgA 肾病肾损伤，同时C3a 在IgA 肾病发病中作用强于C5a。

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