重组BCG 的抑瘤活性及免疫学机制研究①

薛庆节 李秀真 李运清 杨媛媛 胡文洁 章洪华 吕厚东 李士根

(济宁医学院病原生物学教研室，医学免疫学省级重点学科，济宁 272067)

EB 病毒(Epstein-Barr virus，EBV)为1964 年Epstein 和Barr 等用改良组织培养技术自非洲儿童恶性淋巴瘤细胞培养物中发现的一种新型病毒，属于双链DNA 病毒，为人类疱疹病毒4 型。其具有嗜淋巴细胞的特性，在世界各地都有分布。在EBV 原发感染中，约半数患者出现传染性单核细胞增多症。非洲儿童恶性淋巴瘤及鼻咽癌易发于感染过EB 病毒的患者，故现在普遍认为EB 病毒是人类重要的肿瘤相关病毒［1］。本研究拟将文献［2］构建成功的包含GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)基因与EB 病毒表面蛋白基因LMP2A 的重组BCG(rBCG)进行免疫学及抑瘤活性研究，进一步评价rBCG 的作用和效果。

1 材料与方法

1.1 材料 GT39(EB 病毒阳性胃癌细胞)为青岛大学罗兵教授馈赠、FIFC 标记的兔抗鼠CD4、PE 标记的兔抗鼠CD8a 购自BD PharmingenTM公司;CTL杀伤活性检测试剂盒为Promega 公司产品;小鼠淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司;中性蛋白酶DISPASE 购自Roche 公司;6 周龄的C57BL/6 小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司;鼠IFN-ELISPOT 预包被试剂盒购自北京旷博生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EB 病毒阳性肿瘤预防模型的建立及免疫策略 雌性6 周龄的C57BL/6 小鼠随机分4 组，每组中有18 只小鼠，用6 只进行肿瘤细胞的形态学实验、6 只需进行免疫机制分析、最后6 只需进行生存观测。第一组注射PBS 作为对照;第二组注射BCG作为对照;第三组注射含空载体pMV261 的BCG 作对照;第四组注射含目的基因的重组BCG。

培养GT39 细胞，收集指数生长期细胞，用PBS调整细胞浓度，倒置显微镜计数，使浓度为1 ×107个/ml。无菌操作在2 只C57BL/6 雌性小鼠右肋腹侧皮下，分别一次性接种250 μl/鼠。1 个月后处死荷瘤小鼠，无菌操作剥下瘤体。碾碎瘤体并匀浆，加4℃冰冷后的PBS 混合，200 目滤网过滤肿瘤细胞，用PBS 调细胞浓度为2 ×105个/ml，最后一次免疫后10 d 将培养好的肿瘤细胞无菌操作250 μl/鼠接种于C57BL/6 雌性小鼠右肋腹侧皮下，9 d 后随机分组。

对实验小鼠C57BL/6 在进行肿瘤接种前30 d，连续3 次进行疫苗接种，中间间隔10 d，免疫时采用右肋腹侧皮下注射的方式进行，第一组于右肋腹侧皮下注射250 μl PBS/(次·只)作对照;第二组皮下注射250 μl BCG(5 ×108个细菌溶于250 μl PBS中)/次/只;第三组注射含空载体pMV261 的BCG(5 ×108个细菌溶于250 μl PBS 中)/(次·只);第四组注射含目的基因的重组BCG(5 ×108个细菌溶于250 μl PBS 中)/(次·只)。在最后一次免疫后10 d 接种肿瘤细胞。在接种肿瘤细胞后40 d 断颈处死小鼠，手术剥离肿瘤并测定各种数据。

1.2.2 疫苗抑瘤活性测量与分析 观察小鼠皮下肿瘤的生长情况，当可触及肿瘤结节时，记录其成瘤时间;然后每间隔2 d 用游标卡尺测量肿瘤垂直长径(X)及短径(Y)，计算其体积，公式为:肿瘤体积V=X×Y2/2，第40 天(从接种肿瘤细胞起)处死小鼠，手术剥离肿瘤，称取瘤重，进行分析。统计各组瘤体积并计算抑瘤率，肿瘤生长抑制率的计算公式:抑制率(%)=(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

1.2.3 ELISA 法检测血清中特异性抗体 最后一次免疫后第10、20 天，取各实验组小鼠眼眶静脉血，室温下4 h，然后离心(4 000 r/min，离心半径10 cm)10 min，取血清，-20℃保存。用表达纯化的GM-CSF、LMP2A 包被ELISA 板，检测血清中有无特异性抗体及其滴度。

具体步骤如下:(1)用包被液稀释纯化的蛋白质GM-CSF、LMP2A 至浓度为3 μg/ml，100 μl/孔包被平板，冰箱内4℃过夜;(2)24 h 后，将包被液弃去，用ddH2O 洗板2 次并在吸水纸上扣干;(3)2%酪蛋白溶液封闭4 h，然后吸去封闭液，于吸水纸上扣干;(4)将100 μl/孔用PBS 倍比稀释后的小鼠血清加入酶标板，37℃孵育1 h;(5)用PBST 洗板，共5次，然后加入羊抗鼠IgG(HRP 标记)抗体0.1 μg/ml，37℃孵育0.5 h;(6)PBST 洗5 次后，用A、B 液(H2O2+TMB)显色，时间为15 min，最后用100 μl/孔硫酸(1 mol/L)终止反应，酶标仪检测450 nm 的OD 值。

1.2.4 ELISPOT 法检测脾脏细胞特异性细胞因子 单细胞悬液的制备:(1)在末次免疫后第10 天，处死小鼠，将其浸入75%酒精中5 min 后放入已灭菌的超净台内;(2)无菌操作取其脾脏，尽量去除脂肪、结缔组织等，剪碎后置于200 目细胞筛中，将细胞筛放在含3%血清的PBS 的小烧杯中，用研磨杵挤压出脾细胞;(3)用含2%血清的PBS 冲洗研磨出的脾细胞;(4)将淋巴细胞分离液5 加入到15 ml 离心管，将脾细胞悬液缓慢加入到分离液上方，2 500 r/min(离心半径8 cm)冷冻离心机离心0.5 h;(5)取上层白膜，然后加10 ml 含血清PBS 洗2 次(1 200 r/min，5 min，离心半径8 cm);在10 ml 无血清PBS 中重新悬浮并计算细胞的数量。

ELISPOT 法检测脾细胞IFN-γ 分泌:实验设阳性对照1 组(加PMA 刺激)，每个细胞样品(来自同一小鼠)设1 组阴性对照(不加PMA)，另外设一组无细胞，只加检测试剂、培养基的背景阴性对照。操作步骤如下:取出预包被的板，无血清培养基Lympho-SpotTM200 μl，静止10 min，然后弃去;接种稀释成的不同浓度细胞，细胞分布要均匀，100 μl/孔;阳性对照:浓度细胞2.5 ×105个/孔;细胞样品:5 ×105个/孔;背景阴性对照:加无血清培养基础100 μl阳性对照加10 μl 的PMA +离子霉素，使其终浓度为1 μg/ml，以刺激IFN 分泌;加刺激物GM-CSF、LMP2A 蛋白20 μg/孔;样品加完后，放37℃CO2培养箱36 h。在CO2培养箱36 h 后，进行如下操作:(1)倾倒孔内的培养基，每孔加250 μl 冰冷去ddH2O，置于冰箱4℃下10 min，低渗裂解细胞;(2)弃去孔内液体，用缓冲液洗5～6 次，250 μl/孔，每次1 min，最后在吸水纸上扣干;(3)加入酶标亲和素100 μl/孔，37℃下1 h，然后弃去孔内液体，用缓冲液洗5～6 次，250 μl/孔，每次1 min，最后在吸水纸上扣干;(4)将100 μl/孔AEC 显色液加入，避光30 min，每5 min 检查1 次;(5)当斑点生长到合适大小后，以ddH2O 洗2 遍，终止显色。在吸水纸上倒扣反应板，当小水珠干后，取下保护层，置于室温下，让膜晾干;(6)在读板机上将ELISPOT 反应板放好，调节好参数，测定斑点数据。

1.2.5 CTL 杀伤活性检测 (1)制备效应细胞:无菌操作获得rBCG 免疫后的小鼠脾细胞悬液，以15 U/ml 的IL-2 和2.5 μg/ml PHA-P 刺激淋巴细胞生长，另外，我们还加入表达纯化的GM-CSF 蛋白质作刺激物，其浓度为30 μg/ml，CO2培养箱培养过夜后，加终浓度为25 U/ml 的IL-2。再次培养过夜后，每孔吸去0.5 ml 液体，补加含终浓度为25 U/ml 的IL-2 培养液，再培养2 d，把收获的细胞作效应细胞。(2)制备靶细胞:EB 病毒阳性肿瘤细胞置于CO2培养箱中培养备用。(3)检测CTL 活性的检测(乳酸脱氢酶释放法):按照试剂盒Non-Radioactive Cytotxixity Assay(Promega 公司)说明书操作规程进行:自然释放组(效应细胞):收集并调整其细胞浓度，每孔加50 μl，最后补足至100 μl(用无血清培养基);自然释放组(靶细胞):收集并调整其细胞浓度，每孔加1 ×105个/50 μl，最后补足至100 μl(用无血清培养基);最大释放组(靶细胞):收集并调整其细胞浓度，每孔加1 ×105个/50 μl，最后补足至100 μl(用无血清培养基);背景释放组:加100 μl 无血清培养基;实验组:每孔加稀释的效应细胞浓度分别是1 ×106个/50 μl、2 ×106个/50 μl、4 ×106个/50 μl，靶细胞1 ×105个/50 μl;1 200 r/min 离心5 min(离心半径8 cm)，使其充分接触，然后在37℃下CO2培养箱中培养5 h。在细胞孵育结束前40 min，将20 μl 5 ×裂解液加入到靶细胞最大释放孔，培养结束后，3 000 r/min 离心5 min。将离心后获得的上清50 μl 移入新96 孔酶标板中，每孔加入50 μl 底物，避光30 min，然后加50 μl 终止液，完成后读出490 nm 吸光值。CTL 杀伤率的计算:实验组=实验组平均-培养基背景平均;效应细胞自然释放值=效应细胞组自然释放平均-培养基背景平均;靶细胞自然释放值=靶细胞组自然释放平均-培养基背景平均;靶细胞最大释放值=靶细胞组最大释放平均-体积纠正值平均。杀伤率(%)=实验组释放-效应细胞自然释放-靶细胞自然释放/靶细胞最大释放-靶细胞自然释放×100%。

1.2.6 流式细胞术检测 用手术刀剥下免疫小鼠的肿瘤，称约0.4 g，放入6 ml 浓度为0.15%预热蛋白酶溶液(pH7.0)中，于水浴中37℃裂解，用移液器轻吹裂解的肿瘤细胞，在裂解下来的肿瘤细胞中加入相等体积的1640 培养基。然后，将蛋白酶溶液(pH7.0)再次加入未能裂解的组织中，重复上述过程3 次，将中性蛋白酶裂解的肿瘤细胞收集在一起。将4 次裂解得到的肿瘤组织细胞离心(1 000 r/min)，获得的细胞沉淀用1 ml PBS 缓冲液重悬，得到的溶液用200 目滤网过滤，离心收集过滤得到的细胞，用PE 标记兔抗鼠CD8a 抗体、FITC 标记兔抗鼠CD4 抗体(终浓度为2 μg/ml)100 μl 于4℃孵育2 h，然后用10 ml 清洗细胞3 次，用6 μl PBS 重新悬浮细胞沉淀，用流式细胞仪检测免疫小鼠肿瘤中的CD8+、CD4+T 淋巴细胞的数量，并进行分析。

1.2.7 免疫小鼠肿瘤组织形态学观察 对rBCG免疫后小鼠的肿瘤组织石蜡切片进行苏木素-伊红(HE)染色，观察分析其组织形态学变化及免疫后肿瘤组织中肿瘤浸润淋巴细胞是否出现。具体步骤如下:(1)肿瘤的剥离与固定:从免疫小鼠体内剥离肿瘤，放入4%多聚甲醛溶液中固定，以维持细胞的固有形态与结构;(2)组织的脱水与透明化处理:肿瘤经65%、75%、85%乙醇逐级脱水各2 h，再浸入95%、无水乙醇各2 次，每次1.5 h，逐步脱去肿瘤组织中的水份。将脱水后的组织块浸入二甲苯中进行透明处理;(3)包埋:把已透明化处理的肿瘤组织放入溶化的蜡中，置于恒温箱保温。当组织中完全被石蜡浸入后包埋;先叠好几个小纸盒，倒入溶化后的液体石蜡，然后将浸透蜡的组织置于其中，蜡冷却凝固后肿瘤可在其中长期保存;(4)切片:将包埋后的肿瘤固定于切片机上进行切片，切成5 μm 的薄片，为防皱褶的出现，将切下的薄片放入42℃水中;(5)贴片与烤片:将切片在水中伸展之后，用预先涂有1∶1蛋白甘油液的载玻片从水中捞取薄片，将薄片置于中心，晾干后置于37℃干燥箱中烘干;(6)脱蜡:将切片放入二甲苯20 min 以溶去石蜡，然后将其放入另一二甲苯液体漂洗20 min，最后放入二甲苯、无水乙醇(1∶1)溶液中3 min;(7)复原:脱蜡完成后将其置于无水乙醇2 min，然后放入另一新的无水乙醇2 min 以除去二甲苯;然后放入90%、80%、70%、60%、50%的酒精中各浸泡2 min，最后放入蒸馏水中泡2 min;(8)初染:将在蒸馏水中放置后的切片取出浸入苏木精染液10 min;然后水中泡洗2～3 min;细胞质脱色:用盐酸酒精分化至切片呈砖红色(约15～20 s)，然后用自来水冲洗;(9)蓝化:用1%氨水处理1～2 min，然后水漂洗1～2 min;(10)脱水:将切片重新置于65%、75%、85%、95%乙醇逐级脱水，时间各2 min;(11)复染:将切片置于95%酒精伊红混合液中染色5 min，然后用无水乙醇浸泡2 min，共2 次，以完成对组织细胞的脱水;(12)透明化处理:经二甲苯二次各8 min 浸泡，使切处透明化及除去组织中的乙醇;(13)封固:将切片从第二次浸泡的二甲苯中取出，即可滴上中性加拿大树胶，盖上盖玻片封固，平放于干燥处，稍加重压，待干燥后观察。

1.8 统计学分析 对各组数据整理后采用SPSS11.5 软件进行统计学分析，成瘤时间以及肿瘤的重量、体积的采用随机单因素方差分析(ANOVA)统计处理。每两者之间差异进行t 检验，以P ≤0.05 差异有统计学意义，P≤0.01 作为差异非常显著性标准。

2 结果

2.1 小鼠成瘤时间 各组小鼠的成瘤时间如表1所示，第一组时间约为8 d，第二组、第三组成瘤时间与第一组相比无显著性差异;第四组成瘤时间最晚，约为20 d 左右才可以触摸至肿瘤结节。与各对照组相比，差异达显著水平(P≤0.05)，见表1。

2.2 小鼠的存活情况 在皮下接种肿瘤细胞后的100 d 内，第三天观察小鼠的存活情况，结果发现，第一、第二、第三三个对照组在接种45 d 内全都死亡，而第四组重组BCG 免疫后的小鼠在90 d 仍有1只存活，与其余各组相比，差异达显著水平(P ≤0.05)。

2.3 重组BCG 对肿瘤的抑制作用 结果见表2，可以看出，第一、二、三组平均瘤重差异不显著，与各对照组相比，第四组平均重量明显降低，其对肿瘤的抑制率为82%，与对照组的差异达显著水平(P ≤0.05)。

表1 各组免疫小鼠皮下接种肿瘤细胞的成瘤时间Tab.1 Time of tumors formation in each immunized group after inoculation

2.4 ELISA 法检测血清中特异性抗体 对于GMCSF 蛋白的包板，在最后一次免疫后10 d，第四组的抗体滴度为1∶14 800，在最后一次免疫后30 d，第四组的抗体为1∶4600。对于LMP2A蛋白包被的平板，分别为1∶10 000 和1∶1 000，都达非常显著水平(P≤0.01)，见表3、4。

表2 重组BCG 对肿瘤的抑制作用Tab.2 Inhibitory effect of recombinant BCG on tumor

表3 小鼠血清抗体ELISA 检测结果(GM-CSF 蛋白包板)Tab.3 ELISA results of mice serum antibody detection(GM-CSF protein coated board)

表4 小鼠血清抗体ELISA 检测结果(LMP2A 蛋白包板)Tab.4 ELISA results of mice serum antibody detection(LMP2A protein coated board)

表5 各免疫组小鼠ELISPOT 计数结果Tab.5 Count results in ELISPOT of immunization mice

表6 CTL 特异性杀伤活性(%)Tab.6 Specific killing activity of CTL (%)

图1 rBCG 免疫小鼠肿瘤组织肿瘤组织浸润淋巴细胞Fig.1 Infiltrating lymphocytes of tumor tissue of mice immunized with rBCG

2.5 ELISPOT 法检测小鼠IFN-γ 分泌水平 用GM-CSF、LMP2A 融合蛋白(20 μg/孔)作为刺激物对各组免疫小鼠的淋巴细胞进行刺激，对特异性抗原肽有反应的T 淋巴细胞被激活，进而分泌IFN-γ，这些因子被包被的IFN-γ 抗体捕获并通过显色的方式变成斑点。而对GM-CSF、LMP2A 融合蛋白没有反应的淋巴细胞不会产生细胞因子，我们对所形成的斑点进行了计数，结果如表5 显示。

2.6 特异性CTL 检测 按试剂盒操作方法，设定效靶比(E/T)分别为10∶1、20∶1、40∶1，测 定OD490nm 值，分析CTL 活性，随效靶比逐步增加，重组目的蛋白免疫组杀伤能力增加，这说明产生了对肿瘤细胞的特异性杀伤能力，而其他各组变化不明显，重组BCG 组与对照组相比差异显著(P ≤0.05)，结果如表6 所示。

2.7 形态学观察肿瘤浸润淋巴细胞 通过对免疫小鼠肿瘤组织的切片观察，发现在经过重组BCG 免疫的肿瘤组织局部有淋巴细胞浸润现象，如图1 箭头所示。

3 讨论

癌症是当今世界所面临的最严重的疾病之一。传统方法的治疗是用手术切除肿瘤，然后进行化疗和放疗，以防止残留的肿瘤细胞重新大量繁殖。但是，放疗和化疗有非常大的负作用，其在清除肿瘤细胞的同时，对人体正常的组织和细胞亦造成很大的伤害，且疗效有限。

基因工程疫苗是使用DNA 重组技术，把天然的或人工合成的DNA 定向插入到哺乳动物细胞、真菌或细菌中，使之高效表达，经纯化后而制备的疫苗。这种疫苗的构建通常使用高效表达质粒，将编码特异性抗原的多肽或蛋白基因构建到这种质粒中，使其在哺乳动物细胞、真菌或细菌中表达，注射机体后，表达的抗原可激活免疫系统，进而诱导机体自身产生主动的、特异性的体液免疫和细胞免疫，从而达到预防和治疗肿瘤的目的。

抗肿瘤基因工程疫苗是近年来发展起来的一种治疗肿瘤的新方式，虽然出现的时间比较短，但其研究已获得了很大的进展，其有效性已在实验中得到验证，部分疫苗已进入临床试验。

GM-CSF(Granulocyte/macrophase colony-stimulating factor，GM-CSF)全称为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，由144aa 组成，它不但对树突状细胞具有调节作用，而且能促进其增殖与分化，维持细胞活力［3］。另外，该细胞因子还能对树突状细胞的分布和抗原提呈起重要调节作用。因此，被认为是抗肿瘤研究的重要细胞因子。研究表明，将其转移至肿瘤细胞能极大增强肿瘤细胞的免疫原性，提高人体抗肿瘤反应［4-6］。LMP2A 为EB 病毒的潜伏膜蛋白基因，存在于被感染的B 淋巴细胞膜表面，具有阻止潜伏的EB 病毒再次被激活的作用，LMP2A 蛋白不但可刺激机体产生抗体，而且能引发机体CTL 反应［7-9］。Redchenko 等［10］用LMP2A 表位多肽负载DC，诱导出大量的特异性CTL。因此，EB 病毒表面膜蛋白基因LMP2A 可成为其相关肿瘤免疫治疗的靶抗原。本研究设想将GM-CSF 与LMP2A 基因融合并转入表达载体，让其同时在细胞内表达，使机体产生针对EB 病毒阳性肿瘤细胞的体液免疫和细胞免疫，协同杀伤EBV 阳性肿瘤细胞。

卡介苗(BCG)是当今世界上应用的最广泛的减毒活疫苗之一，其能形成胞内菌，既能刺激机体产生体液免疫，又能刺激机体产生细胞免疫。用作抗肿瘤研究的表达载体有其独特的一面［11］。

从实验中可以看出，重组BCG 可诱导C57BL/6小鼠产生较强抗肿瘤作用，对EB 病毒阳性肿瘤细胞具有明显抑制作用。主要表现在肿瘤成瘤时间与其他对照相比明显延迟，肿瘤生长明显缓慢，小鼠生存期延长。这说明重组BCG 诱导机体产生了体液免疫和细胞免疫反应，对接种的肿瘤细胞产生了特异性杀伤。

ELISA 检测结果表明，重组BCG 免疫后能产生针对GM-CSF 和LMP2A 的特异性IgG 抗体，用EB病毒阳性肿瘤细胞GT39 作为靶细胞，以经抗原肽刺激的免疫小鼠脾淋巴细胞作效应细胞，检测特异性CTL。结果发现，在不同的效靶比设定值下，重组BCG 免疫组的小鼠都能检测到特异性CTL 活性，统计分析结果表明，其已达显著水平。

用ELISPOT 法检测免疫小鼠淋巴细胞的IFN分泌情况，将无菌操作分离得到的重组BCG 免疫小鼠脾淋巴细胞用GM-CSF 蛋白质刺激后，加到预包被IFN-抗体的酶标板上，并通过对所形成的斑点计数，发现重组BCG 组检测到的斑点数较多，而其余各对照组没有检测到IFN 的分泌，这说明重组BCG疫苗刺激机体后可诱导小鼠的细胞免疫反应。用流式细胞仪及形态学观察的方法检测肿瘤浸润淋巴细胞，发现重组BCG 免疫的小鼠，其肿瘤组织中可检测到有淋巴细胞的浸润生长，这表明重组BCG 的免疫成功募集淋巴细胞到达肿瘤生长部位，出现浸润现象。上述实验为重组BCG 疫苗进一步的药效学及药理学研究奠定了基础，为恶性肿瘤的预防提供了新思路和新方法。

［1］Chung GT，Lung RW，Hui AB，et al.Identification of a recurrent transforming UBR5-ZNF423 fusion gene in EBV-associated nasopharngeal carcinoma［J］.Pathol，2013，22(10):4240-4247.

［2］薛庆节，吕厚东，梁卫平，等.GM-SCF 与LMP2A 融合基因重组腺病毒载体的构建与鉴定［J］.中华肿瘤防治杂志，2013，20(5):1675-1680.

［3］Parviainen S，Ahonen M，Diaconu I，et al.GM-CSF-armed vaccinia virus induces an antitumor immune response［J］.Int J Cancer，2014，10(2):68-74.

［4］Heather SLJ，Tim DB，Margaret BJ，et al.Granulocyte macrophage colony stimulating factor treatment is associated with improved cognition in cancer patients［J］.Brain Disord Ther，2012，1(1):172-178.

［5］Furugaki K，Cui L，Kunisawa Y，et al..Intraperitoneal administration of a tumor-associated antigen SART3，CD40L and GM-CSF gene-loaded polyplex micelle elicits a vaccine effect in mouse tumor models［J］.PLOS One，2014，9(7):1854-1859.

［6］Van De Laar L，Coffer PJ，Woltman AM Regulation of dendritic cell development by GM-CSF:molecular control and implications for immune homeostasis and therapy ［J］.Blood，2012，119:3383-3393.

［7］Shaojun L，Qiaojuan G，Jin L，et al.The initial results of Epstein-Barr virus (EBV)-encoded latent membrane protein-1 (LMP-1)for screening nasopharyngeal carcinoma (NPC)［J］.Chinese-German J Clin Oncol，2011，10(1):51-55.

［8］Portis T，Longneeker R.Epstein-Barr virus LMP2A interferes with g1obal transcription factor regulation when expressed during Blymphoeyte develoPment［J］.J Virol，2008，77:105-114.

［9］Ying X，Zhang R，Wang H，et al.Lentivirus-mediated RNAi knockdown of LMP2A inhibits the growth of nasopharyngeal carcinoma cell line C666-1 in vitro［J］.Gene，2014，524(1):77-82.

［10］Redchenko IV，Rickinson AB.Accessing Epstein-Barr virus specific T-cell memory with pep tide loaded dendritic cells［J］.J Virol，1999，73:3342-3421.

［11］Xue QJ，Dai J，Li XZ，et al.Construction of a recombinant-BCG containing the LMP2A and BZLF1 genes and its significance in the Epstein-Barr virus positive gastric carcinoma［J］.J Med Virol，2014，86(10):1780-1787.