Slug、E-cadherin、Vimentin及MMP-9在食管鳞状细胞癌侵袭转移中的作用

姜琳娜，路三军，桂红武，魏 娉，杨学丽，尹 峰

(河北省邯郸市第一医院，河北 邯郸 056002)

Slug、E-cadherin、Vimentin及MMP-9在食管鳞状细胞癌侵袭转移中的作用

姜琳娜，路三军，桂红武，魏 娉，杨学丽，尹 峰

(河北省邯郸市第一医院，河北 邯郸 056002)

目的 观察Slug、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及基质金属蛋白酶(MMP-9)在食管鳞状细胞癌中的表达情况，探讨Slug在食管鳞状细胞癌细胞侵袭及转移中的机制。方法 免疫组化法检测70例食管鳞状细胞癌组织、17例癌旁不典型增生组织及20例正常食管黏膜组织中Slug、E-cadherin、Vimentin、MMP-9的表达情况。结果 Slug、Vimentin、MMP-9 在食管鳞状细胞癌中高表达，显著高于正常食管黏膜，且随着恶性程度升高表达增加；E-cadherin在癌组织中表达降低(P<0.05)。在食管癌组织中Slug与Vimentin、MMP-9表达呈正相关(P均<0.05)，与E-cadherin表达呈负相关(P<0.05)。结论 Slug 转录因子通过诱导食管癌细胞EMT的发生及上调MMP-9的表达，在食管癌的发生发展以及癌细胞的浸润和继发转移中发挥重要作用。

食管鳞状细胞癌；Slug；基质金属蛋白酶-9;上皮-间充质转化；波形蛋白

The role of Slug, E-cadherin, Vimentin and MMP-9 in the invasion and metastasis of

上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞在某些生理或病理因素的作用下，失去细胞极性，转化为间质细胞，同时伴有细胞形态与相关基因表达的改变。研究证实，EMT在组织纤维化及肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用[1]，许多上皮来源肿瘤细胞发生EMT后，表现为癌细胞与癌细胞之间黏附性下降，发生解离，侵袭能力增强[2]。Slug 是Snail 锌指转录因子超家族成员之一，其在恶性肿瘤的浸润及继发转移中起到重要作用[3]。本研究采用免疫组化法，通过检测Slug及 E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-9(Matrix metallopeptidase 9 ，MMP-9)在食管鳞状上皮不典型增生、食管鳞状细胞癌及正常对照组织中的表达情况，探讨Slug在食管鳞状细胞癌细胞侵袭及转移中的机制，旨在为今后以Slug基因为靶向的食管癌治疗提供理论依据。

1 临床资料

1.1一般资料 选取我院2012—2014年手术切除食管鳞状细胞癌的标本70例，另取癌旁3 cm以内经病理证实为鳞状上皮中-重度不典型增生的组织标本17例，远端正常食管黏膜20例作为对照。70例食管癌患者术前均未进行免疫治疗、放疗及化疗，且未发现其他器官肿瘤。标本病例中男40例，女30例；年龄45～77(64.6±6.60)岁；高分化16例，中分化36例，低分化18例。

1.2主要试剂 兔抗人Slug多克隆抗体购自北京博奥森公司，兔抗人E-cadherin、Vimentin、MMP-9多克隆抗体、即用型快速免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒及DAB显色试剂均购自福州迈新公司。

1.3实验方法 所有组织用10%甲醛溶液进行固定，进行组织脱水、石蜡包埋。将制备好的石蜡组织切片脱蜡水化，高温修复抗原，分别滴加一抗Slug、E-cadherin、Vimentin、MMP-9，Slug浓度为1∶100，其余为工作液，4 ℃孵育过夜后滴加二抗，室温下孵育30 min，滴加DAB显色液，苏木素复染后常规脱水封片。试验中用已知阳性的组织切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4结果判定标准 Slug以细胞核和/或细胞质出现棕黄色或黄色颗粒为阳性细胞， E-cadherin以胞膜和/或胞质中出现棕黄色或黄色颗粒为阳性细胞，Vimentin、MMP-9以胞质中出现棕黄色或黄色颗粒为阳性细胞。每张切片观察10个高倍视野(×400)，每个视野计数100个肿瘤细胞，根据阳性细胞染色强度评分：未着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞百分比评分：≤10%为1分，11%～25%为2分，26%～75%为3分，76%～100%为4分。将细胞染色程度计分与阳性百分数计分相乘即为综合评分，1～2分为阴性(-)，3～4分为弱阳性(+)，6～8分为阳性()，9～12分为强阳性()，分值≥3即可定为阳性。

1.5统计学方法 采用SPSS 13.0软件包进行统计学分析。样本率的比较采用2检验，并将2个不同指标行Speraman相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1Slug、E-cadherin、Vimentin及MMP-9在食管鳞状细胞癌、食管鳞状上皮不典型增生及正常食管黏膜中的表达 免疫组化染色显示Slug在正常食管黏膜中表达很低，在不典型增生及鳞状细胞癌组织中表达升高，Slug阳性表达主要定位于胞核与胞浆，以胞浆表达为主，见图1及图2；其在食管鳞状细胞癌组织中表达明显高于不典型增生组织(P<0.05)，且随着分化程度降低表达增加。E-cadherin阳性表达主要位于胞浆及包膜，以包膜表达为主，其在正常食管黏膜中高表达,食管鳞状上皮不典型增生及鳞状细胞癌中表达降低，见图3及图4；其在食管鳞状细胞组织中的表达低于不典型增生组织(P<0.05)，且随着分化程度的降低表达减少。Vimentin阳性表达主要位于胞质，在正常食管黏膜表达低，在不典型增生及食管鳞状细胞癌中表达明显升高，见图5及图6；其在食管鳞癌组织中表达明显高于不典型增生组织(P<0.05)，且随分化程度降低表达增加。MMP-9阳性表达主要位于胞浆，且表达主要位于肿瘤细胞侵袭的边缘，其在正常食管黏膜中表达低，在不典型增生及食管癌中表达升高，见图7及图8；其在食管癌中表达高于不典型增生组织(P<0.05)，且随分化程度降低表达增加。见表1。

图1 Slug在正常食管黏膜中的表达(MaxVisionTM法,100×)

图2 Slug在食管鳞状细胞癌中的表达(MaxVisionTM法,100×)

图3 E-cadherin 在正常食管黏膜中的表达(MaxVisionTM法,100×)

图4 E-cadherin在食管鳞状细胞癌中的表达(MaxVisionTM法,100×)

2.2Slug与E-cadherin、Vimentin及MMP-9表达相关性 Spearman等级相关分析显示，Slug蛋白与E-cadherin的表达呈负相关(r=-0.283，P<0.05)，Slug蛋白与Vimentin的表达呈显著正相关(r=0.354，P<0.01)，Slug蛋白与MMP-9的表达呈正相关(r= 0.244，P<0.05)，见表2。

3 讨 论

食管癌是食管黏膜上皮或腺体发生的恶性肿瘤，其中侵袭及转移是主要死亡原因，因此深入研究影响肿瘤侵袭及转移的机制，寻求肿瘤的新靶点，对食管癌的治疗及提高患者生存率有重大意义。EMT是一种以上皮细胞标志物如E-cadherin、细胞角蛋白等减弱或消失，间质细胞标志物如Vimentin、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等表达增加，同时MMP等表达上调，肌动蛋白细胞骨架重组，细胞间的黏附和极性丢失，干细胞样特性出现等为特征的细胞表型转化过程。大量研究表明，极性上皮细胞获得具侵袭和转移能力的间质细胞表型是肿瘤细胞的发生和转移的重要机制。

图5 Vimentin在正常食管黏膜中的表达(MaxVisionTM法,100×)

图6 Vimentin在食管鳞状细胞癌中的表达(MaxVisionTM法,100×)

图7 MMP-9在正常食管黏膜中的表达(MaxVisionTM法,100×)

图8 MMP-9在食管鳞状细胞癌中的表达(MaxVisionTM法,100×)

Slug又称Snail2，是一种具有锌指结构的上皮—间质转化转录因子，在多种组织中表达，包括胎盘，成人的心、肝、肾、胰和骨骼肌。主要作用与神经嵴细胞的发育以及中胚层来源的器官形成相关，表达在上皮细胞和未分化的间质细胞中，维持未分化表型[4]。Slug在调节多种恶性肿瘤发生EMT中发挥关键作用[5]。研究表明，Slug可通过下调E-cadherin的表达促进肿瘤细胞EMT的发生[6]。但在对胰腺癌的研究中，有报道认为Slug与E-cadherin的表达并不存在相关性[7]。本实验结果显示，从正常食管黏膜—鳞状上皮不典型增生—食管鳞状细胞癌转变过程中，Slug的表达呈上升趋势，在中、低分化鳞状细胞癌中表达比高分化明显增加。并且Slug的表达与Vimentin成正相关，与E-cadherin成负相关，此结果与Uchikado等[8]报道一致。Slug基因可通过抑制E-cadherin的表达，促进间叶细胞标记Vimentin表达，诱导食管癌细胞EMT的发生，进而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。

表1 Slug 、E-cadherin、Vimentin及MMP-9在食管鳞状细胞癌、食管鳞状上皮不典型增生及正常食管黏膜中的表达 例(%)

表2 Slug 、E-cadherin、Vimentin及MMP-9在食管鳞状细胞癌中的表达相关性 例

MMPs是一族锌肽酶超家族, 具有降解细胞外基质成分的能力, 是目前已知的唯一能降解胶原纤维的酶类。其以酶原形式分泌而成，激活后形成的Ⅳ型胶原酶通过降解、破坏表面基底膜中的胶原、层黏连蛋白、纤维连接蛋白促进肿瘤的侵袭转移过程[9]。研究发现,MMP-3、MMP-7、MMP-9和MMP-13能诱导细胞发生EMT，使细胞获得更强的侵袭性[10]。Joseph等[11]研究表明，Slug可增强MMP-9的表达，进而促进口腔鳞状细胞癌的进展。Zhang等[7]对胰腺癌的相关研究显示，Slug可通过显著上调MMP-9的表达及肌动蛋白骨架的重组促进胰腺癌细胞的侵袭和转移 。本实验结果表明，随着食管癌恶性程度的增高，MMP-9表达增加，其特点是胞质内有棕黄色颗粒,胞核不着色,表达阳性的肿瘤细胞多位于浸润前沿。MMP-9作为细胞外基质降解过程中必不可少的酶，其大量分泌破坏细胞外基质结构，为肿瘤细胞向外侵袭开辟了道路。本研究还显示，MMP-9的表达与Slug表达呈正相关,Slug可能通过增强MMP-9的表达，促进食管癌的侵袭和转移。

综上所述，Slug 转录因子通过诱导食管癌细胞EMT的发生及上调MMP-9的表达，在食管癌的发生发展以及癌细胞的浸润和继发转移中发挥重要作用，因而推测其可能成为食管癌治疗的新靶点。

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[1] Lopez-Novoa JM,Nieto MA. Inflammation and EMT: an alliance towards organ fibrosis and cancer progression[J]. EMBO Mol Med,2009,1(6/7):303-314

[2] 何春年,张鸿瑞,徐翠清,等. 子宫颈上皮内瘤变和子宫颈鳞癌中Twist基因蛋白及Skp2表达[J]. 临床与实验病理学杂志,2011,27(5):468-472

[3] Wang X,Zhang K,Sun L,et al. Short interfering RNA directed against Slug blocks tumor growth, metastasis formation, and vascular leakage in bladder cancer[J]. Med Oncol,2010,29:119

[4] Savagner P. Laving the neighbor rhood: molecular mechanisms involved during epithelial-mesenchymal transition[J]. Bioessays,2001,23(10):912-923

[5] Kudo-Saito C,Shirako H,Takeuchi T,et al. Cancer metastasis is accelerated through immunosuppression during Snail-induced EMT of cancer cells[J]. Cancer Cell,2009,15:195-206

[6] Tanaka Y,Terai Y,Kawaguchi H,et al. Prognostic impact of EMT(epithelial-mesenchymal-transition)-related protein expression in endometrial cancer[J]. Cancer Biol Ther,2013,14:13-19

[7] Zhang K,Chen D,Jiao X,et al. Slug enhances invasion ability of pancreatic cancer cells through upregulation of matrix metalloproteinase-9 and actin cytoskeleton remodeling[J]. Lab Invest,2011,91:426-438

[8] Uchikado Y,Natsugoe S,Okumura H,et al. Slug expression in the E-cadherin preserved tumors is related to prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J]. Clin Cancer Res,2005,11:1174-1180

[9] Karahan N,Guney M,Baspinar S,et al. Expression of gelatinase (MMP-2 and MMP-9) and cyclooxygenase-2 (COX-2) in endometrial carcinoma[J]. Eur J Gynaecol Oncol,2007,28(3):184-188

[10] Cowden Dahl KD,Symowicz J,Ning Y,et al. Matrix metalloproteinase 9 is a mediator of epidermal growth factor-dependent e-cadherin loss in ovarian carcinoma cells[J]. Cancer Res,2008,68(12):4606-4613

[11] Joseph MJ,Dangi-Garimella S,Shields MA,et al. Slug is a downstream mediator of transforming growth factor-beta1-induced matrix metalloproteinase-9 expression and invasion of oral cancer cells[J]. J Cell Biochem，2009，108(3):726-736

esophageal squamous cell carcinoma

JIANG Linna, LU Sanjun, GUI Hongwu, WEI Ping, YANG Xueli, YIN Feng

(The Fisrt Hospital of Handan City, Handan 056002, Hebei, China)

Objective It is to observe the expression of Slug, E-cadherin, Vimentin and MMP-9 in esophageal squamous cell carcinomas, and evaluate the mechanism of Slug in the invasion and metastases of esophageal squamous cell carcinomas. Methods Immunohistochemical method was used to detect the expression of Slug, E-cadherin, Vimentin and MMP-9 in 70 cases of esophageal squamous cell carcinoma tissue, 17 cases of squamous atypical hyperplasia tissue and 20 cases of normal esophageal mucosa tissue. Results The protein levels of Slug, Vimentin and MMP-9 in esophageal squamous cell carcinoma were showed higher expression, and they were significantly higher than that in normal esophageal mucosa tissue (allP<0.05), and the expressions increased with the malignant degree. The expression of E-cadherin was decreased in esophageal cancer tissues (P<0.05). The level of MMP-9 expression of Slug was positively correlated with Vimentin and MMP-9 in esophageal cancer tissue (allP<0.05), and was negative correction with E-cadherin (P<0.05). Conclusion Slug plays a important role in the process of invasion and metastasis by induce epithelial-mesenchymal transition and up-regulating the expression of MMP-9 in esophageal cancer.

esophageal squamous cell carcinomas; Slug; MMP-9; epithelial-mesenchymal transition; Vimentin

姜琳娜，女，主治医师，硕士研究生，研究方向为食管癌。

路三军，E-mail：lusanjun211@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.06.006

R735.2

A

1008-8849(2015)06-0586-04

2014-09-10