实时定量PCR检测乳腺癌患者内皮素-1的表达及其临床意义*

潘小平，洪晓绿，蔡高涛

(广州市花都区人民医院：1.检验科；2.感染科 510800)



·论 著·

实时定量PCR检测乳腺癌患者内皮素-1的表达及其临床意义*

潘小平1，洪晓绿2，蔡高涛1

(广州市花都区人民医院：1.检验科；2.感染科 510800)

目的 检测内皮素-1(EDN-1)基因在乳腺癌患者外周血中的表达情况，并探讨它在乳腺癌的发生、发展中的作用。方法 选取2013年1月1日至2014年5月20日在花都区人民医院接受乳腺手术且经病理学证实为乳腺癌的患者54例纳入试验组，另选取同期体检健康女性60例纳入对照组。采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测所有研究对象外周血EDN-1的表达情况，并分析其与各临床参数的关系。结果 乳腺癌患者外周血EDN-1表达水平高于体检健康女性，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，其表达水平为健康女性人群的5.877倍；EDN-1的表达水平与患者的年龄和肿瘤的组织类型均无关(P>0.05)，与患者的肿瘤大小、区域淋巴结转移情况、是否有远处转移密切相关(P<0.05)。结论 EDN-1基因与乳腺癌的发生、发展关系密切，实时定量PCR可以敏感、特异地检测乳腺癌患者外周血中EDN-1的表达，可以为乳腺癌的筛查与早期诊断提供帮助，宜在临床工作中开展。

内皮素-1基因； 乳腺癌； 实时定量聚合酶链反应

内皮素(EDN)是一种细胞因子，它包括EDN-1、EDN-2和EDN-3，其传导系统在细胞的增殖、分化及转移过程中起重要作用[1]。大量研究表明，EDN传导系统的改变可以调节细胞的存活率，增强细胞的侵袭力，最终导致肿瘤的发生[2]。本研究采用实时定量聚合酶链反应(实时定量PCR)检测EDN-1在乳腺癌中的表达情况，研究其与乳腺癌的关系，为探索乳腺癌的发生、发展提供新的证据，从而为乳腺癌的诊断和治疗提供新的途径。

1 资料与方法

1.1 标本来源 选取2013年1月1日至2014年5月20日在本院接受乳腺手术且经病理学证实为乳腺癌的女性患者54例纳入试验组，患者年龄33～74岁，平均(50.1±10.4)岁，其中年龄不超过50岁者32例，>50岁者22例。参照2003年版世界卫生组织(WHO)乳腺癌分类标准，其中T1期40例、T2期11例、T3期1例、T4期2例；区域淋巴结转移N0期36例，N1-3期18例；远处转移M0期45例，M1期9例；组织类型中导管型36例，小叶型18例。另选取本院同期体检健康女性60例纳入对照组，年龄23～74岁，平均(40.9±12.3)岁。

1.2 仪器及试剂 C1000 Thermal cycler 聚合酶链反应(PCR)仪(美国Bio-RAD公司)，7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，AF100制冷机(意大利Scotsman公司)，UV-1750紫外分光光度仪(日本岛津公司)，ABI 3900台式高通量DNA合成仪(美国Invitrogen公司)。Trizol购自美国Invitrogen公司(批号9109)；焦碳酸二乙酯(DEPC)购自美国Sigma公司；脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)购自美国Promega公司(批号M610A)；SYBR Premix EX Taq ⅡKit(批号RR820A)和PrimeScriptTMRT reagent Kit(批号RR047A)均购自日本TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计与合成 在美国国家生物信息中心(NCBI)核酸序列数据库(Genebank)上查找目的基因和内参基因mRNA序列，采用Primer express 2.0软件设计引物，利用ABI 3900台式高通量DNA合成仪对引物序列进行合成，引物序列见表1。

表1 试验引物序列

1.3.2 外周血总RNA提取及cDNA合成 使用Trizol Reagant试剂盒提取所有研究对象的外周血总RNA，随后采用RNase-free的DNase Ⅰ试剂盒提纯总RNA。取1 μL RNA样品稀释50倍，在紫外分光光度仪上测定吸光度(A)比值(A260/A280)，检测RNA纯度；取1 μL RNA，1%琼脂糖凝胶电泳80 V，20 min，凝胶成像系统观察总RNA的5s核糖体RNA(5s rRNA)，18s rRNA和28s rRNA条带，鉴定RNA抽提质量。取4 μL RNA，应用随机引物和PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录试剂盒合成cDNA，总体积20 μL，反应条件：37 ℃ 15 min，然后85 ℃ 5 s，-80 ℃保存备用。

1.3.3 实时定量PCR 配制25 μL实时定量PCR反应体系，其中cDNA 2 μL，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPS)0.5 μL，Taq酶0.5 μL，10×PCR反应缓冲液2.5 μL，10 pmol/μL上、下游引物各0.5 μL，蒸馏水18.5 μL。反应条件：93 ℃ 2 min，然后93 ℃ 15 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，共40个循环。设定熔解曲线程序：93 ℃ 1 min，60 ℃ 15 s，60 ℃ 10 s，从60 ℃缓慢升温至93 ℃，每升高0.5 ℃检测1次荧光信号值，反应结束仪器自动生成循环阈值(Ct值)及熔解曲线图。将cDNA以10倍倍比稀释，以1、10-1、10-2、10-3、10-4cDNA作为模板，同时对EDN-1、β-actin进行实时定量-PCR，检测其扩增效率是否一致。

2 结 果

2.1 RNA纯度及抽提质量 将提纯的RNA在紫外分光光度仪上测定A260/A280比值均在1.8～2.0，证明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA、18s rRNA和28s rRNA条带清晰可见，证明总RNA抽提比较完整。见图1。

注：1～8号孔为不同样本的总RNA。

图1 总RNA的5s rRNA、18s rRNA和28s rRNA电泳图

2.2 熔解曲线图 EDN-1和β-actin各自的熔解曲线只有一条主峰，无其他杂峰干扰，熔解温度均在82 ℃左右，证明实时定量PCR产物并非引物二聚体或其他杂带，特异性较好。见图2～3。

2.3 扩增效率检测 倍比稀释的cDNA，经实时定量PCR后，以拷贝数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，拟合作图，得到EDN-1与β-actin的标准曲线，斜率分别为-3.395 231及-3.399 973，相关系数分别为0.999 259及0.999 408，说明定量结果准确可靠；根据斜率分别计算出基因扩增效率：EEDN-1=0.97，Eβ-actin=0.97(扩增效率E = 10-1/斜率-1)，证明EDN-1与β-actin的扩增效率相同，可采用2-△△Ct法分析本试验结果。

图2 EDN-1产物熔解曲线图

2.4 实时定量PCR结果

2.4.1 两组EDN-1的表达水平比较 乳腺癌患者EDN-1的表达水平较对照组明显增加，其表达水平为对照组的5.877倍，组间EDN-1表达水平比较差异有统计学意义(r=8.246,P=0.000)。见表2。

2.4.2 乳腺癌患者EDN-1的表达与各临床参数的关系 各年龄段及各肿瘤组织类型的患者EDN-1表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；而不同肿瘤大小，不同区域淋巴结转移情况，以及有、无远处转移的患者EDN-1表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4.3 乳腺癌患者△Ct均值与各临床参数的相关性分析 △Ct均值同样与患者的年龄和肿瘤的组织类型无明显相关性(P>0.05)；与是否有远处转移密切相关(r=-0.290，P<0.05)，与肿瘤的大小和区域淋巴结转移情况显著性相关(r=-0.622、-0.427，P<0.01)，见表3。

图3 β-actin产物熔解曲线图

组别n△Ct-△△Ct2-△△Ct试验组54-3.114±1.4832.555±1.3245.877(2.347～14.713)对照组60-0.559±1.790

表3 乳腺癌患者EDN-1的表达水平与各临床参数的关系±s)

3 讨 论

EDN广泛表达于脑、骨骼肌、胰腺、小肠、睾丸等组织中[4]。EDN经前体蛋白翻译后，裂解出一种含有21个氨基酸的生物活性物质[5]，它们通过自分泌和旁分泌的方式与细胞表面的EDN-A和EDN-B受体 (EDNRA和EDNRB)相互作用[6]，参与细胞的生物功能，如细胞的增殖、分化及诱导细胞转移等[7]。有研究证实，EDN与许多肿瘤有关，如卵巢癌、前列腺癌、成骨细胞瘤等[8-10]。然而，EDN能否导致乳腺癌的发生，以及它与乳腺癌的发展、转移等过程是否有关联却少见报道。

因此，本研究采用本实验室建立的实时定量PCR反应体系及条件，检测了54例乳腺癌患者及60例体检健康女性全血EDN-1水平，结果发现，乳腺癌患者全血EDN-1表达水平较对照组明显增加，其表达水平为对照组的5.877倍，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，说明EDN-1与乳腺癌的发生有明显的相关性，该结论与Wulfing 等[11]报道相同。进一步在乳腺癌各临床变量之间比较EDN-1表达水平发现，EDN-1的表达水平与患者的年龄和肿瘤组织类型无关(P>0.05)，说明无论乳腺癌患者的年龄处在什么阶段，EDN-1都会高度表达，并且在小叶型和导管型乳腺癌中EDN-1均会大量表达。但在不同肿瘤大小、区域淋巴结转移情况，以及有、无远处转移的患者间比较中，EDN-1的表达存在差异，肿瘤越大，其表达水平越高；乳腺癌伴随有淋巴结转移，且淋巴结转移的数目越多，EDN-1的表达水平也越高；乳腺肿瘤若转移至其他器官，EDN-1的表达水平也会增加，这说明EDN-1与乳腺癌的发展有明显的相关性。而苗瑞政等[12]采用放射免疫分析法检测EDN-1水平，不同肿瘤大小间比较并无差异，这与本研究结果有所不同，可能与采用不同的乳腺癌分类方法和不同的检测方法有关。

本实验只研究了EDN-1在乳腺癌患者中的表达情况，缺乏两者之间因果关系的研究，即未能说明是乳腺癌的发生导致了EDN-1水平的增加，还是因为EDN-1的改变导致乳腺癌的发生。同时也缺乏EDN的其他两个成员(EDN-2与EDN-3)在乳腺癌中的表达情况的研究，缺乏三者之间的比较。但有研究表明，大鼠和狗体内EDN-3能负性调节EDN-1的生物活性[13]，提示在人体组织或癌性组织中，EDN-1的高表达可能也受到EDN-3的调节，但有待进一步的研究证实。另外，EDN-1在乳腺癌组织中的表达是否与外周血中的表达情况一致，也是本课题需要进一步研究的内容。

综上所述，乳腺癌患者EDN-1的表达水平较健康女性有明显增加，与患者的年龄和肿瘤的组织类型无关，而与肿瘤的大小、区域淋巴结转移情况、是否有远处转移有明显的关联性，证明EDN-1的增加与乳腺癌的发生、发展关系密切。而实时定量PCR可以敏感、特异地检测乳腺癌患者外周血中EDN-1的表达，能为乳腺癌的筛查与早期诊断提供帮助。临床工作中，将EDN-1作为乳腺癌的辅助检查之一，可以为临床诊治提供及时、准确的参考，宜在临床工作中开展。

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Determination of endothelin-1 expression in breast carcinoma by using real-time quantitative PCR and its clinical significance*

PANXiao-ping1，HONGXiao-lu2，CAIGao-tao1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofInfection,HuaduDistrictPeople′sHospital,Guangzhou,Guangdong510800,China)

Objective To detect the expression of endothelin-1(EDN-1) gene in peripheral blood of the patients with breast carcinoma,and to investigate its role in the occurrence and development of breast carcinoma.Methods A total of 54 patients with pathologically confirmed breast carcinoma receiving operation in our hospital from 1st Jan.2013 to 20th May 2014 were selected as the experimental group.Other 60 healthy women of physical examination were selected as the control group.The real-time quantitative PCR was adopted to detect the expression of EDN-1 gene in peripheral blood of all objects.The relationships between the EDN-1 gene expression and clinicopathological parameters were analyzed.Results The expression of peripheral blood EDN-1 gene in the patients with breast carcinoma was significantly higher than that in healthy women,the difference was statistically significant (P<0.01)，and the expression level of EDN-1 gene was 5.877 times higher than that of healthy women.The expression level of EDN-1 had no correlation with the age of patients and the pathological types of breast carcinoma(P>0.05),while had close correlation with the tumor size,regional lymph node metastasis and distant metastasis(P<0.05).Conclusion EDN-1 gene might closely correlated with the occurrence and development of breast carcinoma.The real-time quantitative PCR could sensitively and specifically detect the peripheral blood expression of EDN-1 gene in breast carcinoma,which might be helpful for the screening and early diagnosis of breast carcinoma and could be carried out in clinical practice.

endothelin-1 gene； breast carcinoma； real-time quantitative PCR

广州市医药卫生科技项目(20131A011187)。

潘小平，男，硕士，主管检验技师，主要从事临床生化与分子诊断学研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.005

A

1672-9455(2015)05-0587-04

2014-10-16

2014-12-10)