血浆miR-324-5p对单纯性先天性心脏病预后风险分级的评估

万 楠，王 璐，孟冬娅，郑 伟，胡晓芳

(沈阳军区总医院检验科，沈阳 110016)



·论 著·

血浆miR-324-5p对单纯性先天性心脏病预后风险分级的评估

万 楠，王 璐，孟冬娅，郑 伟，胡晓芳△

(沈阳军区总医院检验科，沈阳 110016)

目的 研究单纯性先天性心脏病(CHD)患者血浆miR-324-5p表达变化，评价其在CHD预后和风险分级等方面的临床应用价值。方法 选取2012年1月至2013年1月沈阳军区总医院先天性心脏病内科收治的CHD患儿76例为CHD组，另选取13例健康者血清标本为对照组，应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血浆中miR-324-5p的表达变化，通过Kalpan-Meier生存分析、Cox比例风险模型等综合评价血浆miR-324-5p在CHD预后和风险分级等方面的临床应用价值。结果 与对照组相比，单纯性CHD患者外周血浆miR-324-5p表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)；Kaplan-Meier生存分析表明，miR-324-5p表达水平较高组患者复发风险及死亡概率更高(P<0.05)；Cox比例风险模型分析表明，在单因素分析中，miR-324-5p表达水平和体质量指数(BMI)是CHD的发病危险因子(P<0.05)，风险比(HR)分别为1.79和2.17；在多因素分析中，只有BMI是CHD的发病危险因子(P<0.05)，HR为1.38，HR 95%置信区间(CI)为(1.12，1.79)。结论 血浆miR-324-5p作为CHD诊断的生物学标志物具有一定的临床应用价值，但还需要与其他指标联合应用。

先天性心脏病； miR-324-5p； 预后

先天性心脏病(CHD)是一种常见的先天畸形，据相关文献报道其在新生儿中的发病率为1.25%[1]。尽管目前相关检测和治疗手段已经提高，但是CHD引起的死亡仍占新生儿死亡的3%，占先天畸形死亡的46%[2]。目前对CHD的治疗以手术为主，这不仅给患儿及其家庭带来沉重的经济负担，且近50%的患儿面临着再次手术、心律失常及心力衰竭等问题[3-6]。因此，对CHD患者的预后判断和风险分级尤为重要，尽早地对高风险患者进行相关治疗，对提高患者的生存率和生活质量有着重要意义。miR-324-5p位于17染色体短臂1区3带1亚带(17p13.1)，编码于酰基辅酶A脱氢酶第35个内含子并与其共转录。以往关于miR-324-5p的研究多集中于肿瘤，近期的研究指出循环系统miR-324-5p可用于诊断心力衰竭，提示miR-324-5p与心血管系统密切相关。因此，本研究通过检测外周血清miR-324-5p来阐明CHD的疾病发生、发展机制，并为治疗及预后提供有价值的信息。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年1月至2013年1月本院先天性心脏病内科收治的76例单纯性CHD患者为CHD组；另选取本科健康者13例为对照组，所有单纯性CHD患者均具有典型的临床表现，且经心脏超声和手术确诊。

1.2 方法 所有患者于入院前抽取静脉血2 mL，乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，3 000 r/min离心15 min，分离血浆于-20 ℃冻存备用。

1.2.1 血浆微RNA(miRNA)的提取 采用天根生化(北京)科技有限公司RNAprep pure Tissue Kit试剂盒(批号DP121221)进行血浆miRNAs提取，提取的miRNAs于-70 ℃保存以防止降解。

1.2.2 miR-324-5p反转录 采用茎环反转录方法进行miR-324-5p反转录。茎环实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)引物：5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG ACA CCA AT-3′；反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。应用TaKaRa Real-Time PCR试剂盒，以U6为内参照基因进行实时荧光定量PCR分析，正向引物：5′-ACA CTC CAG CTG GGC GCA TCC CCT AGG GC-3′；反向引物：5′-TGG TGT CGT GGA GTC G-3′；内参基因U6-sense：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；U6-antisense：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′。实时荧光定量PCR反应在ABI Prism 7500型高通量荧光定量仪(美国ABI公司)上进行，反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循环40次，95 ℃ 5 s。反应结果采用标准曲线法进行分析，每个样品重复3次，取平均值。

2 结 果

2.1 实时荧光定量PCR检测血清中miR-324-5p的表达水平 与对照组相比，CHD患者外周血浆miR-324-5p表达水平升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A为两组血浆miR-324-5p相对表达水平，与CHD组比较，aP<0.05；B为实时荧光定量PCR产物凝胶电泳图。

图1 CHD患儿与对照组血浆miR-324-5p 表达情况

2.2 Kalpan-Meier生存分析 以miR-324-5p表达水平的中位数0.157为标准将CHD患者分为高表达组与低表达组。在1年的随访中，由于各种原因造成失访的患者11例，其余CHD患者中发生死亡3例，肺动脉高压4例，心律失常8例，心力衰竭4例，肺炎2例。对数秩检验分析结果表明，miR-324-5p表达水平较高的患者将承受更多的发病风险及较高的死亡概率(χ2=4.456，P=0.035)。

2.3 CHD发病风险分析 CHD组与对照组的患儿年龄、体质量指数(BMI)、血红蛋白与血小板水平及miR-324-5p表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。将以上因素代入Cox比例风险模型进行分析，单因素分析发现，miR-324-5p表达水平和BMI都是CHD的发病危险因子，风险比(HR)分别为1.79(P=0.046)和2.17(P<0.01)；但在多因素分析中，只有BMI是CHD的发病危险因子(P=0.021)，HR为1.38，HR 95%置信区间(CI)为(1.12，1.79)。见表2。

表1 两组基本资料比较或n(%)]

注：amiR-324-5p表达水平用2-ΔCt中位数表示，2-ΔCt=2-(Ct miR-324-5p- CtU6)。

表2 CHD发病危险因素的Cox比例风险模型单因素分析

注：amiR-324-5p表达水平用2-ΔCt中位数表示，2-ΔCt=2-(Ct miR-324-5p- CtU6)。

3 讨 论

miRNAs是一类内源性的、非编码的小分子(18～24个核苷酸)RNA，通过与靶基因3 -UTR互补结合，在转录后水平负性调控靶基因表达。miRNAs的表达具有组织特异性和发育阶段特异性，在心脏发育、骨骼肌增殖分化和肿瘤疾病中都起着重要的作用[7-9]。细胞内miRNAs水平异常表达已被证实与许多心血管疾病，如心力衰竭、心肌肥大及心血管重塑等密切相关。一些miRNAs在心血管组织中高表达，它们在调控心血管的发育和疾病方面具有重要意义，这给CHD的诊断和治疗带来了希望[10-12]。早期的miRNAs研究主要集中于组织或细胞，在临床上无法用于CHD的诊断。近几年的研究表明，人外周血清中也存在丰富的miRNAs，并且十分稳定，能抵抗RNA酶降解，并可以抵御酸、碱和高温等不良环境，室温放置一周仍稳定。这使得血清miRNAs具备了常规检测指标的基本条件。同时在疾病状态下，血液循环中的miRNAs主要来自患病的组织细胞的主动分泌，并通过外泌体、微小体等载体传送到微循环中的免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞或其他的受体细胞中，进而影响这些受体细胞的功能。

以往研究miR-324-5p多集中于肿瘤，而Ellis等[13]提出循环系统miR-324-5p可用于诊断心力衰竭，提示其与心血管系统密切相关。本研究首先通过实时荧光定量PCR方法初步分析循环系统miR-324-5p在疾病人群中的表达分布状况，结果表明CHD患者血清miR-324-5p表达水平较对照组明显增高。随后Kaplan-Meier生存分析表明，miR-324-5p高表达患者的预后较低表达患者差，将承受更多的发病风险及较高的死亡概率。进一步采用Cox比例风险模型分析CHD的发病危险因素，在单因素分析中发现miR-324-5p表达水平和BMI都是CHD的发病危险因子，HR分别为1.79和2.17；但在多因素分析中，只有BMI是CHD的发病危险因子，HR为1.38。说明miR-324-5p在CHD的发病机制上并不是一个主要因素，可能处于一个旁路通道中，这也同时说明CHD的发病是多种因素综合作用的结果，miR-324-5p并未起到决定性作用。另一方面，miR-324-5p通过调控细胞多种生物学表现，导致下游基因和细胞生物学性状的一系列变化。作者认为在胚胎心脏发育过程中miR-324-5p通过直接或间接抑制某些基因表达来调节心肌细胞的凋亡和增殖，当miR-324-5p的表达失调，影响某个或某些靶基因表达水平并发生失控，继而引起心脏形态和功能的异常，导致CHD发生。

综上所述，在多因素分析中miR-324-5p虽然不是CHD的发病危险因子，但是miR-324-5p高表达的CHD患者却有较高的死亡概率和发病风险，提示可以将它作为临床预后判断的辅助指标，对提高CHD患者的生存质量有着一定的指导意义。

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Plasma miR-324-5p for evaluation of prognostic risk classification in patients with simple congenital heart disease

WANNan，WANGLu，MENGDong-ya，ZHENGWei，HUXiao-fang△

(DepartmentofClinicalLaboratory,GeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang,Liaoning110016,China)

Objective To investigate the change of plasma miR-324-5p expression in the patients with simple congenital heart disease(CHD) and to evaluate its clinical application value in the prognosis and the risk classification of CHD.Methods 76 children patients with CHD and 13 healthy controls were detected the plasma expression levels of miR-324-5p by the real-time PCR.The clinical application value of plasma miR-324-5p in the prognosis and the risk classification of CHD was comprehensively evaluated by adopting the Kalpan-Meier survival analysis,Cox proportional hazard model.Results The peripheral plasma miR-324-5p expression level in the simple CHD group was increased compared with the control group,the difference had statistical significance (P<0.05);the Kalpan-Meier survival analysis indicated that the higher miR-324-5p expression group had much higher recurrent risk and much higher death probability(P<0.05);the Cox proportional hazard model indicated that in the univariate analysis,miR-324-5p and BMI were the risk factors of CHD(P<0.05).The hazard ratio (HR) was 1.79 and 2.17 respectively.The multivariate analysis demonstrated that only BMI was the risk factor of CHD(P<0.05),HR was 1.38,95%CI(1.12，1.79).Conclusion Plasma miR-324-5p as a biomarker of CHD diagnosis could have certain clinical application value,but should be combined application with other indicators.

congenital heart disease; miR-324-5p; prognosis

万楠，男，硕士，副主任技师，主要从事心血管疾病风险研究。△

，E-mail：syplay@me.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.010

A

1672-9455(2015)05-0603-03

2014-10-26

2014-12-10)