武汉市乙型肝炎病毒基因型分布和P区耐药突变模式及两者相关性分析*

崔 艳，李 艳，乔 斌，汪 明

(武汉大学人民医院检验科，武汉 430060)



·论 著·

武汉市乙型肝炎病毒基因型分布和P区耐药突变模式及两者相关性分析*

崔 艳，李 艳△，乔 斌，汪 明

(武汉大学人民医院检验科，武汉 430060)

目的 探讨武汉地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情况和P区耐药突变模式及两者的相关性。方法 提取HBV-DNA进行聚合酶链反应(PCR)扩增后以直接测序法检测HBV基因型及P区耐药突变位点，用SPSS19.0软件进行统计学分析。结果 219例慢性乙型肝炎患者血浆中检出HBV基因型B型135例(61.6%)、C型61例(27.9%)、D型2例(0.9%)、B+C混合型3例(1.4%)、B+F+G混合型1例(0.4%)、未分型17例(7.8%)。对202例分出基因型的标本进行耐药突变检测，其中76例发生耐药突变，突变位点以M204I(42.9%)、M204V(22.1%)、L180M(27.3%)多见。YMDD突变的发生率在B、C基因型之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，但YMDD突变类型中的M204V和M204I在B、C基因型中的分布比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 武汉地区HBV基因型以B型和C型为主，HBV耐药突变以M204I、M204V、L180M多见，临床医生应根据基因分型和耐药突变结果为慢性乙型肝炎患者选择适合的治疗方案。

乙型肝炎病毒； 基因型； 耐药突变； 核苷(酸)类似物

乙型肝炎病毒(HBV)基因型包括A～H,不同地区的分布特征可能存在差异，我国以B、C型常见，还有少量D型。基因型是影响HBV感染结果的主要决定因素之一，不同基因型的致病性有所差异，并且与临床表现、预后、治疗应答均有一定的关系[1]。目前，临床应用最广泛的抗HBV药物为核苷(酸)类似物，但由于长期及不规范用药，使HBV产生耐药突变，影响了治疗效果。因此，本研究进行HBV基因型分型及耐药变异检测，以期为临床医生合理用药提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 219例血浆标本均来自本院2011年4月至2014年4月门诊及住院部的慢性乙型肝炎患者，年龄18～76岁，其中男183例，女36例。慢性肝炎的诊断标准符合中华医学会肝病学分会和感染病学分会于2010年更新的《慢性乙型肝炎防治指南》[2]。所有患者血浆丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)等检测均为阴性。

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA提取 HBV-DNA提取采用上海莱枫生物科技有限公司生产的体液游离DNA微量提取试剂盒，提取过程严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.2 HBV基因分型及耐药突变检测 对待检血浆标本中提取的HBV-DNA进行Pol基因RT区核酸聚合酶链反应(PCR)扩增后直接测序，测序引物为上海生工合成，上游引物为5′-TGG ACT TCT CTC AAT TTT CT-3′，下游引物为5′-TGA CAG ACT TTC CAA TCA AT-3′，采用美国ABI公司3500测序仪及其配套试剂检测，并将所测序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI)核酸序列数据库(GenBank)中HBV-DNA Pol基因RT区参考序列AF100309、AB014381和X51970等进行比对分析，确定受检血浆标本中HBV-DNA的基因型，以及所检测区域是否发生耐药突变和其耐药突变类型。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计学软件进行数据处理与统计学分析，计数资料以例数、频次或百分率表示，组间比较采用χ2检验；以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HBV-DNA基因型分布及耐药分布 219例慢性乙型肝炎患者血浆中共检出HBV基因型B型135例(61.6%)、C型61例(27.9%)、D型2例(0.9%)、B+C混合型3例(1.4%)及B+F+G混合型1例(0.4%)、未分型17例(7.8%)。B基因型标本中50例发生耐药突变，C基因型标本中26例发生耐药突变，B、C基因型耐药突变发生率比较差异无统计学意义(χ2=3.609，P=0.057)。HBV耐药突变检测结果见图1。

图1 HBV耐药突变检测结果

2.2 HBV耐药模式分布 对202例基因分型标本中HBV-DNA的P区进行测序，其中12例没有发生突变，113例发生的突变尚不确定与核苷(酸)类似物耐药相关，76例明确发生耐药突变。与耐药相关的单个氨基酸突变模式见表1。

表1 HBV单个氨基酸突变模式结果

表2 HBV YMDD突变与基因型的关系

表3 HBV YMDD突变类型与基因型的关系

2.3 YMDD突变与基因型之间的关系 B基因型和C基因型YMDD突变的发生率比较，差异无统计学意义(χ2=1.783,P=0.182)；而YMDD突变类型中的M204V和M204I在B、C两种基因型中的分布比较差异有统计学意义(χ2=6.01,P=0.014)。见表2～3。

3 讨 论

HBV基因型分布呈现一定的地区差异性，其中A基因型主要分布在欧洲西部、北部及非洲撒哈拉沙漠地区；B、C型主要分布在远东东部和亚洲南部；D型的分布较广，常见于地中海地区及近东地区,同时在亚洲少数地区也有发现；E型主要在非洲撒哈拉沙漠地区；F型主要分布在美国[3]。本研究显示，武汉市慢性乙型肝炎患者的基因型以B型(61.6%)为主，其次为C型(27.9%)，这一结果符合我国HBV基因型南方以B型为主、北方以C型为主的分布特征[4-5]。此外，在本次研究中还发现了在我国较少见的几种基因型，其中D型2例(0.9%)、B+C混合型3例(1.4%)、B+F+G混合型1例(0.4%)，由此可见武汉市HBV基因型分布有复杂化的趋势。临床上进行HBV基因分型检测具有相当重要的意义，与B基因型相比，C基因型的HBV感染更易发生重症肝病、肝硬化、肝癌等肝脏疾病。此外，C基因型HBV感染者的乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性率较高，病毒复制活跃，免疫清除比较晚，不易发生HBeAg血清转化[1]。而且，不同基因型的HBV对抗病毒治疗药物的反应有着十分大的差异，总体上B基因型比C基因型易治疗[6]。

目前已明确有抗HBV效果的药物包括核苷(酸)类似物及α干扰素，其中以核苷(酸)类似物应用最为广泛。但由于核苷(酸)类似物的长期应用及不规范用药，使HBV产生耐药突变，影响了治疗效果。因此，定期进行HBV耐药变异相关检测对指导临床医生用药具有相当重要的意义。我国慢性乙型肝炎抗病毒治疗专家委员会认为采用核苷(酸)类似物来进行长期治疗的关注点在于选择性耐药位点的出现，治疗期间至少应该每3个月进行一次HBV-DNA耐药变异检测[7]。

本研究中，76例标本检出有核苷(酸)类似物相关耐药变异，突变位点以M204I(42.9%)、M204V(22.1%)、L180M(27.3%)多见，其中M204I/V位点的变异与拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦的耐药相关。L180M位点的变异常引起拉米夫定、替比夫定、恩曲他滨、恩替卡韦发生耐药。A181T/V、N236T、L80I/V、V84M等位点的变异与阿德福伟的耐药有关，其中A181T位点突变较为特殊，除了可引起拉米夫定、替比夫定、阿德福韦的非典型耐药以外，还影响S蛋白的表达分泌[8]。此外，rtA181位点变异被认为是多药耐药的标志，此位点的变异除了导致阿德福韦耐药外，还可引起替诺福韦、拉米夫定和替比夫定耐药[8]，有文献建议临床上治疗rtA18l位点突变的患者应该采用替诺福韦与恩替卡韦联合用药的治疗方案[9]。

YMDD变异是HBV对拉米夫定最常见的耐药变异模式。耐药基因位点YMDD位于聚合酶的C区(rtM204I或rtM204V)，分别是YMDD中的蛋氨酸(M)被异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)所取代，形成YIDD或YVDD变异，这两种变异分别是HBV基因组第739位碱基腺嘌呤(A)被鸟嘌呤(G)替代和第741位碱基鸟嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)替代[10-11]。本研究分析了拉米夫定经典耐药中的YMDD突变与基因型的关系，以及YMDD突变类型与基因型的关系。分析显示，YMDD的发生在B、C基因型之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，而YMDD中的M204I、M204V在B、C基因型中的分布比较差异有统计学意义(P<0.05)。YMDD突变比例随着服药时间的延长而增加，服用拉米夫定第1、2、3、4年的耐药发生率分别为14%、38%、49%和66%[12]。也有文献表明YMDD突变的发生率可能与HBeAg和HBV-DNA水平具有相关性[13-14]。

综上所述，临床医生在治疗慢性乙型肝炎时应结合HBV基因分型和耐药突变模式及其他检测结果制订出合理的治疗方案，从而达到理想的治疗效果。

[1]李艳，李金明．个体化医疗中的临床分子诊断[M]．北京：人民卫生出版社，2013：197-198．

[2]中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会．慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J]．中华肝脏病杂志，2011，19(1)：13-24．

[3]Sunbul M．Hepatitis B virus genotypes:global distribution and clinical importance[J]．World J Gastroenterol，2014，20(18)：5427-5434．

[4]刘纯，刘伟，王凯，等．天津地区慢性乙型肝炎患者病毒基因型的分析及临床意义[J]．中华医院感染学杂志，2014，24(10)：174-179．

[5]刘会彩，陈国华．乙型肝炎病毒基因分型与临床的相关性探讨[J]．中国实用医药，2014，9(12)：90-91．

[6]明月，谢奇峰，杨林．B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白调控细胞凋亡的比较研究[J]．中华实验和临床病毒学杂志，2013，27(5)：344-347．

[7]慢性乙型肝炎抗病毒治疗专家委员会．慢性乙型肝炎抗病毒治疗专家共识：电子版[J]．中华实验和临床感染病杂志，2010，4(1)：49-53．

[8]Warner N，Locarnini S．The antiviral drug selected hepatitis B virus rtA18lT/sWl72＊mutant has a dominant negative secretion defect and alters the typical profile of viral rebound[J]．Hepatology，2008，48(1)：88-98．

[9]Zoulim F，Locarnini S．Hepatitis B virus resistance to nucleos(t)ide analogues[J]．Gastroenterology，2009，137(5)：1593-1608．

[10]Yang J，Zhang H，Chen X，et al．Relationship between hepatocellular carcinoma and hepatitis B virus genotype with spontaneous YMDD mutations[J]．World J Gastroenterol，2013，12(24)：398-404．

[11]Ozekinci T，Mese S，Ozbek E，et al．Lamivudine and adefovir motif variants detected in chronic hepatitis B patients[J]．Clin Ter，2014，165(1)：13-17．

[12]Wu F，Wu MJ，Zhuge XL，et al．Correlation of the occurrence of YMDD mutations with HBV genotypes,HBV-DNA levels,and HBeAg status in Chinese patients with chronic hepatitis B during lamivudine treatment[J]．Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2012，11(2)：172-176．

[13]张笠，高武，刘小荣．慢性乙型肝炎患者YMDD突变与HBV DNA定量水平相关性研究[J]．国际检验医学杂志，2012，33(22)：2724-2726．

[14]Tan YW，Ge GH，Zhao W，et al．YMDD motif mutations in chronic hepatitis B antiviral treatment naive patients:a multi-center study[J]．Braz J Infect Dis，2012，16(3)：250-255．

Distribution of genotypes of hepatitis B virus in Wuhan and P region drug resistance mutation patterns and their correlation analysis*

CUIYan,LIYan△,QIAOBin,WANGMing

(DepartmentofClinicalLaboratory,People′sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China)

Objective To study the distribution of hepatitis B virus(HBV) genotypes and its correlation with the mutation patterns in the P region of HBV.Methods HBV DNA was extracted for conducting PCR.Then the HBV genotypes and P region drug resistance mutation sites were detected by using the direct sequencing method and the detection results were statistically analyzed by using the SPSS 19.0 software.Results Among 219 patients with chronic hepatitis B,135 cases(61.6%) of HBV genotype B,61 cases(27.9%) of genotype C,2 cases (0.9%) of genotype D,3 cases (1.4%) of genotype B+C,1 case(0.4%) of genotype B+F+G and 17 cases (7.8%) of undefined genotype were detected out.Among them,76 cases developed the drug resistance mutation,the mutation sites were mainly M204I(42.9%),M204V(22.1%) and L180M(27.3%).The occurrence rate of YMDD mutation had no statistically significant difference between the gynotype B and C (P>0.05).But in the YMDD mutation patterns,M204I and M204V had statistical difference in the distribution of C and D genotypes(P<0.05).Conclusion The HBV genotypes in Wuhan are mainly genotype B and C.The major drug resistant mutations are M204I,M204V and L180M.Clinical doctors should select the proper therapeutical scheme for treating chronic hepatitis B based on the results of the genotyping and drug-resistant mutations.

hepatitis B virus； genotype; drug-resistant mutation； nucleos(t)ide analogues

国家重点临床专科建设项目(财社【2010】305号)。

崔艳，女，在读研究生，主要从事分子诊断研究。△

，E-mail：yanli.1120@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.001

A

1672-9455(2015)05-0577-03

2014-11-05

2014-12-16)