不同营养盐条件下赤潮高发区围隔生态系内多胺的变化

刘 艳， 赵卫红，苗 辉

1 中国科学院海洋研究所， 海洋生态与环境科学重点实验室, 青岛 266071 2 中国科学院大学, 北京 100049 3 临沂大学， 资源环境学院, 临沂 276005

不同营养盐条件下赤潮高发区围隔生态系内多胺的变化

刘 艳1,2,3， 赵卫红1,*，苗 辉1

1 中国科学院海洋研究所， 海洋生态与环境科学重点实验室, 青岛 266071 2 中国科学院大学, 北京 100049 3 临沂大学， 资源环境学院, 临沂 276005

在东海赤潮爆发区域运用围隔生态系实验方法，研究了不同营养盐条件下围隔生态系内多胺浓度变化。结果表明：2010年选用东海原甲藻赤潮爆发处海水，东海原甲藻是各围隔生态系内主要优势种，没有种群演替现象发生。两种营养盐添加方式下各围隔内精胺浓度维持较高水平，都呈现先波折下降后波折上升的趋势，与东海原甲藻的生长变化正好相反；各围隔内腐胺浓度水平较高，变化起伏较大，其中有两个实验组腐胺整体变化趋势与东海原甲藻生长趋势类似；所有围隔内亚精胺浓度最低，波动较小。2011年取用中肋骨条藻赤潮爆发处海水，所有围隔生态系内优势种都发生了从中肋骨条藻到东海原甲藻的演替。各围隔生态系内腐胺浓度最高，在中肋骨条藻生长初期腐胺浓度下降，随着中肋骨条藻的生长有所上升，实验后期随着东海原甲藻的生长又整体呈现出下降趋势；各实验组精胺浓度较低，在中肋骨条藻消亡东海原甲藻出现的种群演替期间，都呈现出较大波动；各围隔内亚精胺浓度较低，在整个种群演替过程中没有明显的变化。围隔生态系中补充营养盐，通过对浮游植物生长的影响，间接影响围隔生态系内的多胺变化。

围隔生态系; 营养盐; 中肋骨条藻; 东海原甲藻; 多胺

近年来海洋污染日趋严重，我国东海赤潮频发，并且每年春季存在着从硅藻赤潮向甲藻赤潮的演替过程[1-3]。由于赤潮生物的多样性和环境因素的复杂性，对于赤潮爆发与演替机制还不是很明确，一般认为无机氮、磷酸盐和硅酸盐等营养盐含量增加为赤潮的爆发提供了充足的营养条件，某些特定种类的营养盐输入海域或是海区营养盐比例发生改变时，一些赤潮原因种可能因而具备竞争优势形成赤潮[4-5]。此外，研究发现多胺作为一类具有生物活性的低分子量脂肪族含氮碱,与赤潮的爆发可能有一定的关系。多胺是生理代谢过程中如细胞分裂[6-9]、胁迫反应[10-15]、生长发育[16-20]等的重要调节物，其中最为常见的多胺有腐胺(Putrescine，Put) 、亚精胺(Spermidine，Spd) 和精胺(Spermine，Spm) 等。藻类代谢、消亡和分解会产生多胺类物质，并且会影响到浮游植物种群的演替。在挪威Ofotfjord-Vestford湾报道里氏金色藻赤潮的发生可能是多胺的刺激作用[21]；Gentien曾报道在法国沿岸春天爆发硅藻赤潮后又发生了米氏凯伦藻赤潮，原因很可能是硅藻赤潮的消亡分解产生的腐胺促进了米氏凯伦藻赤潮的生长率，导致赤潮的爆发[22]，因此研究多胺与赤潮的关系是非常有意义的。为了研究不同营养盐条件下东海海域典型赤潮藻的生长及多胺的浓度变化，并进一步探讨富营养化程度、多胺与有赤潮发生之间可能存在的关系。本文分别于2010年5月和2011年5月在长江口海域开展了围隔生态实验[23]。

1 材料与方法

1.1 围隔实验设计

2010年5月11日至5月20日在东海原甲藻爆发区域(123.30 E，30.00 N)取表层水，水样分别加入5个围隔培养袋M1—M5，营养盐浓度设计见表1，围隔实验装置采用由钢骨架支撑的透明聚乙烯材料塑料袋，直径为1 m，深度为1 m，为顶部开放式船基围隔，外部为钢质支架与帆布袋构成的循环水槽。实验期间利用水泵将现场海水抽入帆布袋内作为循环水, 以保持围隔袋内水温与现场海水一致。2011年5月13日至5月30日在舟山群岛朱家尖岛附近海域(122.48 E，29.55 N)，拉取中肋骨条藻赤潮爆发处海水进行海洋围隔实验。围隔材料为聚乙烯塑料袋，直径1 m，深度1 m，容积750 L。为研究不同营养盐条件下赤潮藻生长状况，本次围隔实验共设计5个围隔装置进行研究，营养盐浓度添加情况见表1。每天8:30取样，取样前搅拌混合均匀，样品经GF/F膜(450 ℃灼烧5 h)过滤，于-20 ℃冷冻保存水样带回陆地实验室分析。

表1 2010和2011年围隔装置中营养盐浓度设计(μmol/L)Table 1 Nutrient concentrations added in mesocosm 2010 and 2011

1.2 分析方法

多胺的测定方法：样品测定前进行化冻，取1 mL的海水样品，加入1,6-己二胺作为内标物，使其浓度达到1.0×10-7mol/L，然后加入12 μL的70%的高氯酸，冰箱密封放置30 min，再加入90 μL的2 mol/L的NaOH和pH值9.18的硼酸缓冲液70 μL调节pH值，加入1 mL的5 mg/mL的丹磺酰氯丙酮溶液进行衍生，40 ℃反应45 min，再加入40 μL的25%的浓氨水中止反应，最后加入60 μL的乙腈，过滤进样。衍生物采用Waters e2695高效液相色谱仪和Waters e2475荧光检测器进行测定，色谱柱为C18(150 mm×4.6 mmi.d.， 5 μm particle size，Agilent)；荧光检测激发波长(Ex)340 nm，发射波长(Em)515 nm；柱温40 ℃，流动相 A为乙腈， B为0.1 mol/L的醋酸铵。梯度为0—10 min，35% A-60% A；10—15 min， 60% A-80% A；15—20 min，80% A-100% A；20—30 min，100% A-35% A。此方法可以很好的检测出海水中游离态腐胺、精胺和亚精胺的浓度[24]。营养盐(NO3-N、PO4-P、SiO3-Si)现场用GF/ F 玻璃纤维滤膜(经450 ℃灼烧5 h)过滤后用聚丙烯瓶贮存, -20 ℃冷冻保存带回陆地实验室, 用AA3营养盐自动分析仪测定。Chl-a现场用GF/ F 玻璃纤维滤膜(经450 ℃灼烧5 h) 过滤后, 采用Turner荧光计现场测定。浮游植物水样直接用卢哥氏碘液固定, 带回实验室在倒置显微镜下计数。运用SPSS10.0统计软件分析各组数据之间的差异性。

2 结果与讨论

2.1 2010年围隔浮游植物生物量和多胺的变化

2010年选用东海原甲藻爆发处海水，海水中NO3-N和 SiO3-Si浓度均为10 μmol/L，PO4-P浓度较低仅为0.04 μmol/L。围隔生态系中浮游植物生物量的变化用叶绿素a的浓度变化描述。此次实验围隔用水为东海原甲藻赤潮爆发处海水，整个实验过程中发现所有实验组都是以东海原甲藻为主要优势种，没有明显的演替现象。M2叶绿素-a在第5天达到峰值后下降，M3叶绿素-a一直到第7天达到最高峰值后下降，M3叶绿素-a要高于M2。两个实验组叶绿素-a都要高于对照组M1。M4叶绿素-a第4天达到最高值后下降，第7天后又呈现上升趋势，M5叶绿素-a生长期要长于M4，第5天达到峰值后下降，第7天同样呈现明显的上升趋势。与一次性添加营养盐实验组相比，M4和M5实验组东海原甲藻可以达到的最大生物量要小，生长速率较慢，但生长期较长，两个实验组的叶绿素-a值都要高于对照组M1。各个围隔实验组中腐胺和精胺的浓度较高，变化起伏较大，亚精胺的浓度最低，波动较小。

2.1.1 一次添加营养盐方式下围隔内多胺的变化

M2和M3实验组添加相同浓度的NO3-N，M3实验组添加的PO4-P浓度要高于M2。M2(图1)腐胺的整体变化趋势与叶绿素-a的变化趋势类似，先波折上升然后波折下降；整个实验过程中亚精胺基本呈现波折上升的趋势；精胺在叶绿素-a上升初期呈现下降趋势，第3天之后一直呈现上升趋势，说明东海原甲藻在生长过程中代谢分泌出部分多胺，这与东海现场调查结果具有一致性(数据未发表)，赤潮爆发处多胺的浓度相对较高[25]，Hofle也早在1984年就提到过赤潮爆发区的浮游生物量较大的透光层处多胺的浓度较高[26]。M3(图1)腐胺整体呈现波动变化；精胺变化趋势与M2相似；亚精胺维持比较低的浓度，无明显变化。M2和M3腐胺都明显高于对照组M1(图1)(PM2/M1=0.0178；PM3/M1=0.0198)；M2腐胺略高于M3，但是差异性并不显著(PM2/M3=0.3134)；M2亚精胺在5月18日出现峰值，达到20.3 nmol/L，致使M2亚精胺平均浓度要高于对照组和M3；M2、M3和对照组M1精胺浓度相近， M2和M3围隔生态系内累积的生物量较大，所以体系内累积的多胺浓度要比对照组高。M3 围隔生态系内虽然生物量较大，但是整体多胺浓度要略低于M2，这可能是东海原甲藻生长过程中吸收利用的多胺要多于代谢分泌出的多胺，导致围隔生态系内多胺浓度下降。文献也曾报道赤潮藻在生长过程中可以吸收利用多胺。Iwasaki研究发现不同的微藻可以吸收利用不同的外源多胺化合物[27]。微小亚历山大藻可以吸收利用低浓度的腐胺和降亚精胺[20]；米氏凯伦藻生长过程中会吸收利用腐胺[22]；实验室发现，东海甲藻赤潮生长过程中会吸收利用精胺、腐胺和亚精胺，其中对精胺的吸收作用最为明显[28]。M2和M3在叶绿素-a下降期间，两个实验组腐胺都呈下降趋势，精胺都表现出上升趋势，可能是部分腐胺转化成精胺的缘故，研究发现腐胺经过两次丙胺基转移反应生成精胺[13]。

图1 M1、M2和M3围隔叶绿素a及多胺变化Fig.1 Chlorophyll-a and polyamines variation in M1, M2 and M3

2.1.2 连续添加营养盐方式下围隔内多胺的变化

M4和M5两个实验组每天添加相同浓度的NO3-N，M5每天添加的PO4-P浓度要比M4高。在整个实验过程中，M4(图2)围隔生态系内腐胺整体呈现波动上升的趋势；亚精胺在第3天出现最高峰值，为25 nmol/L，明显高于其他数值(P<0.0001)；精胺在叶绿素a上升期间呈现下降趋势，随着叶绿素-a下降又呈现波折上升趋势；说明在东海原甲藻消亡过程中可能会降解释放出部分精胺。Gentien也曾报道在法国沿岸春天硅藻赤潮爆发后海水中较高浓度的多胺是由于硅藻赤潮消亡分解释放所致[22]。M5(图2)腐胺整体呈现出先波动上升后又波动下降的趋势，亚精胺一直维持着较低浓度，精胺与M4有着类似的变化趋势。M4和M5腐胺都明显高于对照组M1(PM4/M1=0.0391；PM5/M1=0.0391)；M4腐胺浓度要略高于M5，两者的变化趋势类似，差异性不显著(PM4/M5=0.4839)。M4亚精胺在第3天出现峰值导致M4亚精胺平均浓度要明显高于对照组和M5。M4和M5精胺平均浓度都略低于对照组M1，并且第7天叶绿素-a再次上升后，腐胺下降，精胺上升，与M2、M3变化趋势类似，亦可能是部分腐胺转化成精胺的缘故。

图2 2010 年M4和M5围隔叶绿素a及多胺变化Fig.2 Chlorophyll-a and polyamines variation in M4 and M5

2.2 2011年围隔浮游植物生物量和多胺的变化

2011年围隔实验所用海水本底营养盐值较高，实验第4天各实验组(包括对照组M1)中肋骨条藻的密度均超过了107个/L，最高为1.08×108个/L，达到了赤潮爆发密度；所有实验组在中肋骨条藻达到最大生物量后开始消亡，至实验第9天各实验组密度都降到了104个/L。实验第9天左右各实验组可以检测到东海原甲藻，并且其密度均呈现上升趋势，至实验第12天东海原甲藻成为所有实验组的演替优势种，其中M3实验组的东海原甲藻密度近106个/L，基本达到了赤潮爆发的密度。M2、M3、M4和M5实验组中肋骨条藻最大生物量相似，都略高于对照组(PM2/M1=0.0526;PM3/M1=0.0506;PM4/M1=0.0515;PM5/M1=0.0945)。各围隔生态系内腐胺的浓度最高，精胺和亚精胺的浓度都较低。

2.2.1 不同NO3-N浓度下围隔生态系内多胺的变化

M2、M3和M5实验组PO4-P和SiO3-Si具有相同的起始浓度，其中PO4-P浓度较高，为1.5 μmol/L，NO3-N的浓度M3 >M5 >M2。在中肋骨条藻生长期间，各围隔体系内多胺的浓度都维持较高的浓度水平，达到24 noml/L左右，其中腐胺的浓度最高，亚精胺和精胺的浓度较低。在中肋骨条藻生长初期，各实验组腐胺都呈现出下降的趋势，随着中肋骨条藻生长达到最大生物量以及后期消亡过程中，腐胺又呈现上升趋势，M2、M3和 M5(图3)精胺也都呈现出波动变化，说明在中肋骨条藻生长初期可能会利用环境中的部分多胺，而在生长过程中又会代谢分泌出多胺，这与实验室培养中肋骨条藻研究结果一致[29]。实验第8、9天左右围隔生态系内营养盐浓度都维持在很低的浓度水平(PO4-P低于检测限)，M2、M3、M5和对照组 M1(图3)都检测到东海原甲藻，可能是围隔体系内的多胺刺激了东海原甲藻的生长，Gerner曾报道多胺作为类激素物质通过与DNA和RAN相结合调节调节植物的发育及细胞的分裂、分化等生物进程而参与调节细胞的生长[30]。Lee和Jøgensen[31]也研究发现外源多胺可以刺激浮游植物的生长，实验研究发现，多胺的加入能影响赤潮藻的生长，精胺、腐胺和亚精胺浓度在5—100 nmol/L范围内总体上对东海甲藻赤潮生长有促进作用。实验第11天M2和M3实验组进行营养盐补充，促进了东海原甲藻的进一步生长，M3补充的NO3-N浓度高，东海原甲藻达到的最大生物量较大，明显高于M2、M5以及对照组M1。在东海原甲藻生长期间，M2、M3和M5实验组精胺以及M3实验组腐胺都呈现明显的波动变化，可能是中肋骨条藻降解和东海原甲藻代谢分泌所致。

2.2.2 营养盐后期补充对围隔内多胺的变化影响

图3 2011年各围隔实验组种群演替与多胺浓度变化Fig.3 Algal species succession and polyamines variation concentration in mesocosm 2011

M4和M5有相同的营养盐起始浓度，在中肋骨条藻生长期间，M4(图3)和M5实验组多胺的浓度及变化趋势类似，差异性不大，腐胺浓度都略高于对照组M1。实验第7天M4和M5实验组营养盐浓度都很低，尤其是PO4-P和SiO3-Si都降低到检测限以下，此时M4补充NO3-N和SiO3-Si到起始浓度，PO4-P仅补充0.5 μmol/L，M5没有营养盐补充，M4中肋骨条藻仍然消亡，但是消亡的速度要比M5实验组慢，实验第10天检测到东海原甲藻，时间要比M5和对照组M1要晚。由于营养盐补充的缘故M4实验组东海原甲藻生长较快，最大生物量也要高于M5和对照组M1，在东海原甲藻生长期间，M4围隔生态系内累积的多胺浓度较高，波动较大，尤其是腐胺和精胺的浓度都要高于M5，这可能是M4体系内累积的生物量较大，新陈代谢产生的多胺较多。

M2和M3实验组在实验第11天中肋骨条藻完全消亡时进行了营养盐补充，补充时间要比M4实验组要晚，而东海原甲藻可以检测到的时间要比M4早，特别是M2在营养盐浓度很低的条件下检测到的(NO3-N: 0.71 μmol/L, PO4-P: 低于检测限, SiO3-Si:0.13 μmol/L)，可能是前期围隔生态系内累积的多胺刺激了东海原甲藻的出现。M2和M3补充营养盐的时间较晚，维持东海原甲藻的生长时间较长，而M4实验组由于补充时间较早，东海原甲藻在第14天达到最大生物量后开始消亡。在东海原甲藻生长期间，M2和M3围隔体系内多胺浓度要低于M4，变化波动较小，这可能是东海原甲藻生长过程中吸收利用的多胺要高于其代谢分泌出的多胺。

3 结论

(1) 2010年所有围隔生态系内优势种都是以东海原甲藻为主，没有明显的演替现象。2011年围隔实验组都出现了从中肋骨条藻到东海原甲藻种群演替现象。

(2) 围隔生态系中补充营养盐，通过对浮游植物生长的影响，间接影响围隔生态系内的多胺变化，2010年和2011年围隔实验都发现进行营养盐补充的实验组，由于围隔生态系内累积的生物量较大，体系内新陈代谢累积的多胺浓度较高。

(3) 通过2010年和2011年围隔实验发现，东海原甲藻和中肋骨条藻在消亡过程中都会降解产生多胺，东海原甲藻和中肋骨条藻在生长过程中也都会代谢分泌出多胺。另外，在营养盐浓度很低的条件下，多胺还会作为一种类激素物质刺激东海原甲藻的生长，同时腐胺、亚精胺和精胺之间还存在着相互转化，这些因素共同影响围隔生态系内多胺的浓度变化，导致生态系内多胺变化波动较大。

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Effects of nutrient on polyamines variation in the mesocosm in the East China Sea

LIU Yan1,2,3， ZHAO Weihong1,*， MIAO Hui1

1KeyLaboratoryofMarineEcologyandEnvironmentalSciences,InstituteofOceanology,ChineseAcademyofSciences,Qingdao266071,China2UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China3CollegeofResourceandEnvironment,LinyiUniversity,Linyi276005,China

We investigated the effects of different nutrients on the concentration of polyamines by mesocosm experiment in an area of frequent red tide occurrence in the East China Sea. As essential components of cellular regulation, polyamines are synthesized by algae and secreted into the surrounding waters, particularly during the decomposition period following a bloom, and may thus drive the succession of future blooms. In 2010, where blooms of the dinoflagellateProrocentrumdonghaienseoccurred, it was the dominant species, the nutrient content of the water was low, and there was no evidence of species succession in any of the mesocosms. According to our results,P.donghaiensegrowth period length and maximal biomass would be enhanced with increased levels of nutritive salt, specifically PO4. Polyamines were significantly higher in mesocosms to which nutritive salt was added than in the control mesocosm. Spermine levels showed a wavelike, inverse trend decreasing withP.donghaiensegrowth and increasing with its decline. Putrescine concentrations were higher than spermine, fluctuated significantly, and were positively associated with growth ofP.donghaiensein every mesocosm except the control. Spermidine had the lowest concentration of all the polyamines and fluctuated the least in all mesocosms. In 2011, we detected a succession in species fromSkeletonemacostatumtoP.donghaiensein all mesocosms whereS.costatumblooms occurred. The nutrient content of the seawater, specifically PO4, was sufficient to sustain dinoflagellate populations. However, our results suggest that the addition of NO3and SiO3would prolong theS.costatumgrowth period, and increase its maximal biomass. When just NO3concentrations were increased, the absorption of PO4increased significantly, andS.costatumdied off more quickly. This suggests that an influx of NO3could initiate an earlier turnover toP.donghaiense. When more NO3was added, the maximal biomass ofP.donghaiensewas higher. If nutrients are added beforeS.costatumdie-off, the rate of turnover might be slower, delaying the appearance ofP.donghaiense. In every mesocosm in the second year, putrescine concentration was the most abundant polyamine. In the early growth stages ofS.costatum, the level of putrescine initially decreased. Levels then increased withS.costatumgrowth, and fell again withP.donghaiensegrowth in the later stages of the experiment. We suggest thatS.costatumandP.donghaienseabsorb exogenous putrescine, causing it to decrease in the mesocosms. In every mesocosm, spermine concentrations were low and fluctuated greatly during the succession. Similarly, the level of spermidine was low in all microcosms; however, it had no obvious fluctuation during succession. Variation in nutrients affected concentrations of polyamines indirectly by influencing phytoplankton growth. From this 2-year mesocosm experiment, we found that as bothS.costatumandP.donghaiensedecompose, they release polyamines. We refer to this as the dispersion period. We also found that during growth periods both species metabolize and secrete polyamines. In conditions of lower nutrient availability, exogenous polyamines could stimulateP.donghaiensegrowth. Algal enzymes catalyze the conversion of polyamines, and thus the growth and decomposition of these dinoflagellates during times of bloom results in significant polyamine fluctuations.

mesocosm; nutrient;Prorocentrumdonghaiense;Skeletonemacostatum; polyamine

国家重点基础研究发展计划资助项目(2010CB428701); 国家自然科学基金项目(40976047, 41276118)

2013-06-08;

日期:2014-05-16

10.5846/stxb201306081458

*通讯作者Corresponding author.E-mail: whzhao@qdio.ac.cn

刘艳， 赵卫红，苗辉.不同营养盐条件下赤潮高发区围隔生态系内多胺的变化.生态学报,2015,35(8):2659-2666.

Liu Y， Zhao W H， Miao H.Effects of nutrient on polyamines variation in the mesocosm in the East China Sea.Acta Ecologica Sinica,2015,35(8):2659-2666.