基于体外抗肿瘤活性的海洋中药牡蛎提取物HPLC化学轮廓谱研究❋

杨 雪， 马爱翠， 陈 震， 付志飞， 戚 欣， 李 静， 管华诗， 刘红兵❋❋

(1. 中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室，山东 青岛 266003; 2. 山东国际生物科技园发展有限公司，山东 烟台 264670)



基于体外抗肿瘤活性的海洋中药牡蛎提取物HPLC化学轮廓谱研究❋

杨 雪1,2， 马爱翠1， 陈 震1， 付志飞1， 戚 欣1， 李 静1， 管华诗1， 刘红兵1❋❋

(1. 中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室，山东 青岛 266003; 2. 山东国际生物科技园发展有限公司，山东 烟台 264670)

牡蛎等贝壳类中药的90%以上成分都是碳酸钙，现版药典对该类药材的质量控制均以碳酸钙含量为指标。由于贝类中药的功能主治不尽相同，除碳酸钙以外还可能存在其他功效成分。为在有效成分不明确的情况下表征牡蛎饮片的质量，本文在评价抗肿瘤活性的基础上研究牡蛎药材化学轮廓谱，为牡蛎药材的质量控制提供科学依据。收集12批次牡蛎药材，体外测试牡蛎甲醇提取物对9种肿瘤细胞株的增殖抑制作用，发现牡蛎甲醇提取物具有广谱的体外抗肿瘤活性，提示小分子有机质是牡蛎发挥“软坚散结”抗肿瘤作用的不可忽视的药效物质基础。采用高效液相色谱分析化学组成，进行相似度评价；舍去活性较差且化学成分相似度不高的样品，建立化学轮廓谱；采用双变量相关分析考察“谱-效”相关性，发现3个共有峰与活性有明显相关，可以作为质量控制的指标性成分，建立的牡蛎药材甲醇提取物化学轮廓谱能较好地体现其“软坚散结”抗肿瘤功效。

中药牡蛎； 海洋中药； 化学轮廓谱； 抗肿瘤

牡蛎是世界各国沿海常见的可食用贝类，属软体动物门(Mollusca)双壳纲(Bivalvia)丝鳃亚纲(Filibranchia)珍珠贝目(Pteriida)动物。在中国，牡蛎贝壳作为中药使用已有上千年的历史，目前仍为临床常用[1-2]。据中国药典2010版记载，中药牡蛎的基源是牡蛎科动物长牡蛎Ostreagigas、大连湾牡蛎O.talienwhanensis或近江牡蛎O.rivularis的贝壳，能重镇安神，潜阳补阴，软坚散结。

在现版国家药典中，中药牡蛎的质量是以碳酸钙的含量为指标进行控制的。这是由于贝壳中90%以上的成分是以碳酸钙为主的无机盐。除了牡蛎,药典中收载的其它类似中药如瓦楞子等贝壳类药材，均以碳酸钙含量为指标进行质量控制。那么，以贝壳的主要化学成分碳酸钙含量作为该类药材的唯一质控指标，是否合理？已知贝壳类中药的功效各异，蛤壳为化痰止咳药，牡蛎、石决明和珍珠母同为平肝潜阳药；但后三者又有区别，牡蛎兼具软坚散结之功，石决明却能清肝明目，珍珠母则为定惊明目。仅用碳酸钙不能很好地解释贝类中药功有专长的真正原因，该成分不合适作为该类药材质量控制的唯一指标。

贝壳作为软体动物的外骨骼，实际上是一种排列有序的天然有机-无机复合材料。生物矿化学研究表明，贝壳有机质由蛋白质、多糖或糖蛋白、磷蛋白、类胡萝卜素等组成，含量占壳干重的0.3%～5%左右[3-5]。但贝类中药药效物质基础的相关研究，目前仅见有针对无机盐的报道(碳酸钙为主)，未见有针对贝壳有机质及其生物活性的研究报道。基于以上原因，课题组对中药牡蛎的有机质成分开展系统研究[6]。利用高效液相色谱法分析多批次牡蛎甲醇提取物；鉴于中医的软坚散结功效与西医的抗肿瘤功效有着密切的相关性[7-8]，测试样品的体外细胞毒作用；并以活性结果为指导，探讨中药牡蛎药材的化学轮廓谱及可能的效应成分。

1 仪器材料

美国Agilent 1100高效液相色谱仪(包括四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、色谱工作站)；Sunfire C18色谱柱(美国Waters公司，4.6mm×250mm，5μm)；Bond-Elut C18固相萃取柱(100mg,3mL,美国Varian公司)；A-5002酶标仪(奥地利Tecan公司)；MilliQⅡ型纯水系统(美国Millipore公司)。

甲醇、乙腈均为色谱纯(美国Honeywell公司)；其它试剂为分析纯。细胞培养用1640培养基、MEM培养基、DMEM培养基和F12K培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司)。

12批牡蛎饮片(生品)于2008—2011年自山东、河北等地购买(见表1)，经中国海洋大学医药学院刘红兵副教授鉴定，凭证保存于中国海洋大学医药学院生药标本室。

表1 中药牡蛎(生)饮片的来源

体外抗肿瘤实验使用的人慢性髓原白血病K562、人原髓细胞白血病HL-60、人宫颈癌细胞Hela、人非小细胞肺腺癌A549、人肝癌细胞BEL-7402、人肝癌细胞SMMC-7721、人肾癌细胞OS-RC-2、人结直肠腺癌细胞Caco-2、人胃癌细胞MGC80-3等9种肿瘤细胞株，均购自中科院上海细胞库。

2 实验方法

2.1 牡蛎甲醇提取物的制备

取各批牡蛎饮片，粉碎后过40目筛。分别称取100g，加入5倍量甲醇，回流提取1.5h，共提3次。合并提取液，3000r·min-1离心10min；取上清液，40℃减压浓缩至干；加入3mL蒸馏水，涡旋溶解后，过预先活化的C18固相萃取小柱。先用3mL蒸馏水淋洗脱盐，再用6mL甲醇洗脱；收集甲醇洗脱组分，减压干燥，得牡蛎饮片的甲醇提取物S1～S12。

2.2 体外细胞毒活性评价

2.2.1 供试品的制备 分别精密称取牡蛎甲醇提取物S1～S12，加入适量DMSO配成10mg·mL-1的溶液；经0.22μm无菌微孔滤膜过滤后，供体外抗肿瘤活性测试。

2.2.2 体外抗肿瘤实验 肿瘤细胞于37℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱中进行培养，2～3d传代一次。分别取对数生长期的细胞，用相应的培养基配制成2×104～3×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔180μL；培养24h后，实验组每孔加入20μL稀释后的待测样品溶液(样品终浓度50μg·mL-1)，空白对照组加入20μL等倍稀释的溶剂，阳性对照用阿霉素(终浓度0.5μg·mL-1)。继续培养72h后，分别采用SRB法[9-10](对Hela、A549、BEL-7402、SMMC-7721、OS-RC-2、Caco-2和MGC80-3细胞)或MTT[11-12]法(对K562和HL-60细胞)测定。每个样品设6个复孔。按下列公式计算细胞增殖抑制率：抑制率(IR%)=[(A空白对照-A实验组)/A空白对照]×100%。

2.3 牡蛎甲醇提取物的HPLC分析

2.3.1 HPLC色谱条件 Waters Sunfire C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A相为pH=2.5磷酸水溶液，B相为乙腈；洗脱梯度0～5min：5% B；5～25min：5%～100% B；25～35min：100%B；流速1mL·min-1；柱温35℃；进样体积20μL；检测波长210nm。2.3.2 供试品的制备 分别精密称取牡蛎甲醇提取物S1～S12，用HPLC级甲醇溶解，配成浓度为20mg·mL-1的溶液；10000r·min-1离心10min；吸取上清液，即得供试品溶液。

2.4 数据分析软件

HPLC原始数据通过安捷伦工作站Chemstation for LC处理获得峰面积积分数据。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版(国家药典委员会)进行色谱峰对齐、相似度评价和共有峰的识别。使用IBM-SPSS Statistics 19.0进行聚类分析、主成分分析和双变量相关分析。

3 结果与讨论

3.1 牡蛎甲醇提取物的细胞毒活性

从表2可见，各批次牡蛎甲醇提取物都能不同程度地抑制肿瘤细胞的增殖，具有广谱的体外抗肿瘤活性。牡蛎所含的小分子有机质是其发挥“软坚散结”抗肿瘤作用的、不可忽视的重要药效物质基础之一。

为深入探讨牡蛎甲醇提取物的抗肿瘤活性，本研究对以上活性数据分别进行聚类分析(Hierarchical Cluster analysis, HCA)和主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)。以Ward法连接所得的HCA分析结果如图1所示，牡蛎样品S7、S8、S9、S10聚为一类，S3、S4、S5、S6、S11聚为一类，S1、S2、S12聚为一类。

表2 牡蛎甲醇提取物S1～S12对肿瘤细胞的增殖抑制率

根据Kaiser原则，以特征值大于1标准确定要保留的主成分数。结合表3中的信息可知，PC1和PC2特征值大于1，二者累积贡献率达到81.935%，能够反映出绝大部分的信息，因此确定2个主成分，其得分图见图2。由图2可知，牡蛎样品S7、S8、S9、S10聚为一类，S3、S4、S5、S6、S11聚为一类，S1、S2、S12聚为一类。所得结果与HCA结果一致，两种方法可以相互佐证，所得结果真实可靠。结合图2和表2可知，沿横坐标轴的正方向，牡蛎的抗肿瘤活性呈增大趋势。

载荷量的绝对值越大，说明其对应的主成分受该指标的影响也越大。由表4可知，特征值贡献率为70.416%的PC1，对9个细胞株均有较大的正值负荷(>0.7)。特征值贡献率为11.519%的PC2，对各细胞株负荷不大(最高仅-0.499)。由于PC1的特征值贡献率大，是分析的主要方面。因此可以得出结论，各批次的牡蛎甲醇提取物对不同肿瘤细胞增殖抑制表现为广谱性；其中牡蛎饮片S7、S8、S9、S10的甲醇提取物抗肿瘤效果最好，而S1、S2、S12的甲醇提取物效果总体较差。

图2 不同牡蛎对肿瘤细胞增殖抑制的PCA得分图Fig.2 PCA scores of 12 batches of Ostreae concha

成分PC特征值Eigenvalue贡献率/%Individualvariance累计贡献率/%Cumulatevariance16．33770．41670．41621．03711．51981．93530．6537．25189．18640．3844．26393．45050．3343．71097．16060．1641．81998．97970．0770．85699．83580．0090．09799．93290．0060．068100．000

表4 PCA分析所得因子载荷矩阵

3.2 牡蛎甲醇提取物的HPLC化学轮廓谱

取供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件依次进样检测，记录色谱图，得到12份牡蛎饮片甲醇提取物的HPLC图谱(见图3)。将HPLC色谱图积分处理后，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件进行分析，发现样品S1、S12、S2、S4等4批甲醇提取物样品与对照指纹图谱的相似度差异很大，分别为0.09、0.19、0.23和0.30。采用相似度软件，对齐12批牡蛎甲醇提取物的色谱峰后共得到117个峰，其中共有峰仅有3个(峰号8、18、28)。

在本研究中发现化学成分差异较大的样品(S1、S12、S2、S4)与生物活性差异较大的样品(S1、S2、S12)基本一致，提示牡蛎小分子有机质是其发挥“软坚散结”抗肿瘤作用的药效物质基础。基于以上原因，根据抗肿瘤活性数据，舍弃活性较差的样品S1、S2、S12，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，考察牡蛎样品(S3～S11)的化学轮廓谱。结果如图4所示，共标定出10个共有峰(峰号8、18、28、32、35、88、89、93、96、110)。

图3 12批牡蛎饮片甲醇提取物的HPLC图(210 nm)Fig.3 HPLC chromatograms of 12 batches of Ostreae concha (at 210 nm)

图4 活性牡蛎饮片甲醇提取物的HPLC化学轮廓谱(210 nm)Fig.4 HPLC chemical profile of Ostreae concha (at 210 nm)

3.3 牡蛎甲醇提取物的效应成分分析

采用双变量相关分析(bivariate correlation analysis)将药效学信息与HPLC化学轮廓谱信息进行相关性研究，计算各牡蛎甲醇提取物的HPLC色谱峰峰面积与其对应的抗肿瘤活性之间的Pearson相关系数。所得相关系数越大，则表明该色谱峰对活性的影响越大。抗肿瘤活性变量，用抗肿瘤活性PCA中第一主成分(PC1)得分进行表征。关于HPLC色谱峰峰面积变量，由于各牡蛎甲醇提取物HPLC化学轮廓谱差异较大，而所选色谱峰的不同将直接影响CCA结果，为使分析结果更可信，本文分别采用以下两种选取方法进行分析比较。

表5 牡蛎甲醇提取物HPLC色谱峰(排名前20)峰面积和抗肿瘤活性PC1得分之间的Pearson相关系数

Note：*P< 0.05; **P<0.01; ①Peak No.;②Correlation efficient.

方法一 对所有12个样品逐一分析，选取每个样品中含量排名前20的色谱峰，汇总后，取其并集，共得到84个色谱峰；考察所得84个色谱峰峰面积与抗肿瘤活性PC1得分之间的相关性。表5所示的分析结果表明，32号、35号、61号、96号峰和抗肿瘤活性之间存在显著的相关(相关系数>0.7，P<0.01)。

方法二 考察化学轮廓谱10个共有峰与抗肿瘤活性之间的相关性，该方法是中药谱效关系研究中通常采用的策略[13]。表6所示的分析结果表明，共有峰32号、35号、96号峰和抗肿瘤活性PC1得分之间存在明显的相关(相关系数>0.7，P<0.01)。从表6还可看到，12批牡蛎甲醇提取物的3个共有峰(峰号8、18、28)，与抗肿瘤活性的相关性都不大。

表6 牡蛎甲醇提取物HPLC色谱峰(共有峰)峰面积和抗肿瘤活性PC1得分之间的Pearson相关系数

Note：*P< 0.05; **P<0.01; ①Peak No; ②Correlation efficient.

比较方法一和方法二，发现两种方法的结果基本一致，即32号、35号、96号峰与抗肿瘤活性之间存在明显的相关，提示这些色谱峰可能是牡蛎甲醇提取物发挥抗肿瘤作用的药效物质基础。此外，方法一还给出了61号峰。尽管该色谱峰不是牡蛎药材的共有峰，但通过检查峰面积原始数据发现，61号峰在活性较强的样品S6～S10、S3中含量较多，而在活性较弱的样品S1，S2，S12中未检测到，这提示61号峰可能也是牡蛎甲醇提取物抗肿瘤的效应成分之一。

同时，两种相关性分析结果的一致性还表明，本文所建立的化学轮廓谱较为可靠，能反映牡蛎药材“软坚散结”抗肿瘤的药效物质基础。对于HPLC图谱差异较大的中药药材，为获得更能反映生物活性的化学轮廓谱/指纹图谱，有必要舍去活性较差且化学成分相似度不高的样品。同时，在制定药材的质量控制标准时，不应忽视含量较低的化学成分，这些成分有可能是发挥药效的重要活性物质。

牡蛎是多基源药材，除了物种这个主要影响因素以外，还受到生长环境、生长年限等外界因素的影响。目前市售牡蛎药材质量良莠不齐，因此极有必要建立合理、切实可行的药材质量标准评价体系，以保证药材质量的可控性和有效性。牡蛎是贝壳类中药，90%以上成分都是碳酸钙，所含有机质的量低微，阐明其化学组成难度很大。为在有效成分不明确的情况下有效表征牡蛎饮片的质量，本文对多批次牡蛎壳有机质进行提取，在评价其抗肿瘤活性的基础上考察其化学轮廓谱；并利用化学计量学方法对化学组成-生物活性这两者的关联度进行分析，从而确定抗肿瘤效应成分。本研究为其质量控制提供有效方法和科学根据，并为牡蛎“软坚散结”功效物质基础的研究提供依据。

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责任编辑 徐 环

HPLC Profile Analysis of Marine-Derived Traditional Chinese MedicineOstreaeconchaBased on the Anti-Tumor Effectinvitro

YANG Xue1, 2, MA Ai-Cui1, CHEN Zhen1, FU Zhi-Fei1, QI Xin1,LI Jing1, GUAN Hua-Shi1, LIU Hong-Bing1

(1. The Key Laboratory of Marine Drugs, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China； 2. Shandong International Biotechnology Park Development Co. Ltd, Yantai 264670, China)

The quality control ofOstreaeconchain current edition of Chinese pharmacopeia relies on the content of calcium carbonate, which accounts for more than 90% of the gradients ofOstreaeconchaand other shellfishes. Judging from the different efficacies of conch medicine, there may be other functional components other than calcium carbonate. The aim of the present study is to establish the chemical profile ofOstreaeconchabased on the evaluated anti-tumor activity, and to provide a scientific basis for the quality control ofOstreaeconchawithout clarifying the effective components. Twelve batches ofOstreaeconchawere collected and their anti-proliferation effects against nine kinds of cancer cell lines were testedinvitro. The results showed that the methanol extract of theseOstreaeconchahad broad-spectrum anti-tumor activity, suggesting that small molecular components were the effective substances corresponding to its anti-tumor activity. This effect is in accord with the “softening and resolving hard masses” effect ofOstreaeconcha. Chemical compositions of theseOstreaeconchawere further analyzed by HPLC and the similarities were calculated. The simulated chemical profile ofOstreaeconchawas then deduced after dismissing the samples with poor bioactivity and low similarity. By bivariate correlation analysis of the spectrum-effect relationship, the anti-tumor constituents were found to be significantly associated with three common peaks, which could be used as the index components for quality control. Indeed, the established chemical profile of medicinalOstreaeconchacorrelates very well with its “softening and resolving hard masses” effect.

Ostreaeconcha; marine-derived traditional Chinese Medicine; chemical profile; anti-tumor

国家高技术研究发展计划项目(2013AA093003)；山东省优秀中青年科学家科研奖励基金项目(BS2011YY065)资助

2014-08-21；

2014-09-09

杨 雪(1983-)，女，博士。E-mail：yangxue95@163.com

❋❋ 通讯作者： E-mail：liuhongb@ouc.edu.cn

R284

A

1672-5174(2015)09-090-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20150249