中国长江三角洲流域百菌清水生生物基准研究

周军英，王香兰，梁霞，孙红英，葛峰

1. 环境保护部南京环境科学研究所，南京 210042 2. 淮安市公安局淮阴分局DNA检测中心，淮安 223300 3. 南京师范大学生命科学学院，南京 210023

中国长江三角洲流域百菌清水生生物基准研究

周军英1,*，王香兰2，梁霞1，孙红英3，葛峰1

1. 环境保护部南京环境科学研究所，南京 210042 2. 淮安市公安局淮阴分局DNA检测中心，淮安 223300 3. 南京师范大学生命科学学院，南京 210023

通过生态毒理试验，获得百菌清对长江三角洲流域14种代表性水生生物的毒性数据。分别采用评价因子法、物种敏感度分布法和毒性百分数排序法，推导长江三角洲流域百菌清水生生物基准值。评价因子法、物种敏感度分布法和毒性百分数排序法得出的急性基准值分别是0.066 μg·L-1、3.00 μg·L-1和0.51 μg·L-1，慢性基准值分别是0.0089 μg·L-1、0.40 μg·L-1和0.136 μg·L-1。比较了3种方法得出的基准值之间的差异并分析了原因，在此基础上，提出了我国长江三角洲流域百菌清水生生物基准推荐值，并与国外基准值进行了比较。研究结果可为中国农药水质标准制修订及水生生物风险评估提供科学依据。

百菌清；水生生物；基准；长江三角洲流域

Received 15 July 2015 accepted 12 October 2015

水生生物基准是指水环境中的污染物对水生生物及其用途不产生短期和长期有害效应的最大允许浓度[1]。水生生物基准是制订水质标准的基础和科学依据[2]。而水质标准是实施水环境管理的依据[3]，我国是农药生产大国，农药生产过程中的点源排放和农药使用过程中的面源排放都会对水环境及水生生物产生不利影响。因此，必须加强对水体农药污染的控制。但我国针对农药的水质标准非常缺乏，我国现行《地表水环境质量标准》(GB3838—2002)(以下简称“现行《标准》”)包含的农药品种较少，只有14种农药的标准限值[4]。而且该标准的颁布距今已有十多年，在此期间我国农药的生产使用情况发生了很大的变化，其中所列农药品种中有些已被禁用多年，而目前在我国使用量大且对水生生态风险大的农药品种却没有包含进去。另一方面，现行《标准》制订时，我国农药环境基准方面的基础研究特别缺乏，定值主要参考国外的环境基准和标准。由于水生生物基准具有区域性，不同国家和地区代表性物种不同[5]，因而水生生物基准也会随之不同，如果依赖国外水生生物基准值，可能会造成对我国水生生物的“过保护”或“欠保护”。总之，我国现行《标准》无论从所包含的农药品种的数量上，还是从包含农药品种的标准限值上都已跟不上我国农药环境管理的需求，迫切需要加强农药水生生物基准研究，从而为我国农药水质标准的制修订提供科学依据。

百菌清是一种非内吸性广谱杀菌剂，主要作用是防止植物受到真菌的侵染，对多种作物真菌病害具有预防作用，药效期长，在我国广泛使用。但百菌清对水生生物毒性高[6]，在生产和使用过程中，会通过地表径流进入地表水，对鱼类等水生生物的安全造成威胁，从而破坏水生态环境。我国现行《标准》已经将百菌清列为集中式生活饮用水地表水源地特定项目，然而当时确定标准限值时，由于农药基准研究缺乏，定值主要参考国外标准，缺少以我国水生生物为基础的基准数据的支持。长江三角洲流域水系发达，水生生物种类繁多，并且长江三角洲流域不但是农药生产企业集中分布的地区，也是我国农药使用量非常大的地区。

因此，本文开展长江三角洲流域百菌清水生生物基准的制定研究，旨在为我国地表水环境质量标准的修订及百菌清的风险评估及风险管理提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验材料1.1.1 农药品种

75%百菌清水分散粒剂，由东莞市瑞德丰生物科技有限公司提供。

1.1.2 试验物种

(1)试验物种筛选原则

农药水生生物基准制定的受试物种筛选遵循五项原则，即水生生物的区域代表性、生物类群的代表性、物种的敏感性、物种的经济和娱乐价值、作为试验生物的适合性。

(2)不同基准推导方法对物种数量的要求

不同基准推导方法对物种数量的要求不同：评价因子法仅要求获得最敏感物种的毒性数据即可，毒性百分数排序法对物种的要求是至少来自于3门8科的不同物种，而物种敏感度分布法一般要求至少10个物种的毒性数据。在综合考虑基准制定受试物种的筛选原则和3种推导方法的数据要求后，筛选出了长江三角洲流域14种代表性水生生物，分属于6门13科，包含了3个营养级别，覆盖了我国长江三角洲流域水生生态系统的主要分类类群和功能类群。各试验生物具体如表1。

1.2 试验方法1.2.1 急性毒性试验方法

(1)大型溞、长江华溪蟹和中华绒鳌蟹等9种水生生物的急性毒性试验

大型溞、长江华溪蟹、中华绒鳌蟹、日本沼虾、泽陆蛙、中华大蟾蜍、鲫鱼、黄颡鱼和蛋白核小球藻等9种水生生物急性毒性试验，参照《化学农药环境安全评价试验准则》[7-11]。

预试验：按正式试验的条件，以较大的间距设若干浓度组和一个空白对照组，每个处理组和空白对照组放入一定数目的试验生物，不设重复，确定正式试验的浓度范围。

表1 试验物种及其特征Table 1 Test species and their characteristics

注：1，南京师范大学生命科学学院；2，环境保护部南京环境科学研究所；3，浙江省湖州市；4，江苏省海洋水产研究所；5，南京市水产科学研究所；6，南京大学模式动物研究所；7，南京市栖霞区；8，安徽省宣城市杨柳镇。

Note: 1, College of Life Science, Nanjing Normal University; 2, Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection; 3, Huzhou of Zhejiang Province; 4, The Marine Fisheries Research Institute in Jiangsu Province; 5, Nanjing Institute of Aquatic Science; 6, Model Animals Research Center of Nanjing University; 7, Qixia District in Nanjing; 8, YangLiu Town Xuan City in Anhui Province.

正式试验：在预试验确定的浓度范围内以一定比例间距设置5～7个浓度组，并设空白对照组。每个处理组和空白对照组均设置重复，每个重复放一定数目的试验生物。试验开始后定时观察并记录试验生物中毒或受抑制情况及死亡数。用Trimmed Spearman-Karber法计算受试生物在试验截止期的半数效应浓度(EC50)或半致死浓度(LC50)。

(2)大乳头水螅、中华圆田螺和狭萝卜螺的急性毒性试验

大乳头水螅、中华圆田螺和狭萝卜螺急性毒性试验方法，参照文献《微囊藻毒素-LR对大乳头水螅的急性毒性研究》[12]和《阿维菌素对几种淡水生物毒性及在银鲫体内药物代谢动力学》[13]。

预试验：按正式试验的条件，以较大的间距设若干浓度组和一个空白对照组，每个处理组放入5只试验生物，不设重复，确定正式试验的浓度范围。

正式试验：在预试验确定的浓度范围内以一定比例间距设置5～7个浓度组，并设空白对照组。每个处理组和空白对照组均设置重复，每个重复放5只试验生物，试验开始后，于24 h、48 h、72 h和96 h定时观察和记录试验生物中毒情况和死亡数，死亡个体及时移出。大乳头水螅对刺激无反应或已消亡被定为死亡，中华圆田螺和狭萝卜螺用解剖针刺激2秒内无反应被定为死亡。用Trimmed Spearman-Karber法计算试验生物96 h的LC50值。

(3)浮萍和紫萍的急性毒性试验

浮萍和紫萍急性毒性试验方法，参照《化学品测试方法221-浮萍生长抑制试验》[14]。

预试验：按正式试验的条件，以较大的间距设若干浓度组和一个空白对照组，每个处理组放入5株试验生物，每个处理组设置3个重复，确定正式试验的浓度范围。

正式试验：在预试验确定的浓度范围内以一定比例间距设置5～7个浓度组，并设空白对照组。每个处理组和空白对照组均设置重复，每个重复放5株浮萍或紫萍，每株浮萍或紫萍需要2～4片叶片，置于光照培养箱内培养，于0 d、3 d、5 d和7 d定时观察和记录叶片的数目和死亡情况。用Trimmed Spearman-Karber法计算浮萍7 d的EC50值。

1.2.2 慢性毒性试验方法

(1)大型溞的慢性毒性试验

大型溞慢性毒性试验方法，参照《化学品测试方法211-大型溞繁殖试验》[14]。

预试验：按正式试验的条件，以较大的间距设若干浓度组和一个空白对照组，每个处理组放入1只幼溞，设10个重复，确定正式试验的浓度范围。

正式试验：应预先知道受试物的毒性，以便选择适当的试验浓度，正式试验一般包括5个浓度，按几何级数排列，浓度的间隔系数不大于3.2，并设空白对照，每个试验浓度和空白对照均设10个重复，每个重复放1只幼溞。试验持续21 d，每天喂食并观察母溞的生长情况及所产的幼溞数，及时移出幼溞。用SPSS19.0软件进行加权方差分析(ANOVA)，确定大型溞21 d无可观察效应浓度(NOEC)。

(2)黄颡鱼和斑马鱼的慢性毒性试验

黄颡鱼和斑马鱼慢性毒性试验方法，参照《化学品测试方法215-鱼类幼体生长试验》[14]。

预试验：按正式试验的条件，以较大的间距设若干浓度组和一个空白对照组，每个处理组放入10鱼，不设重复，确定正式试验的浓度范围。正式试验：应先设计预实验从而知道受试物的毒性，以便选择适当的试验浓度，正式试验一般包括5个浓度，按几何级数排列，浓度的间隔系数不大于3.2，并设空白对照，每个试验浓度和空白对照均设10个重复，每个重复放一定数目的幼鱼。试验持续28 d，每天喂食并观察幼鱼的生长情况。用SPSS19.0软件进行加权方差分析(ANOVA)，确定黄颡鱼和斑马鱼28 d无可观察效应浓度(LOEC)。

1.2.3 基准推导方法

采用以下3种方法推导水生生物基准值。

(1)评价因子法

评价因子法是用敏感生物的毒性数据除以相应的评价因子来获得水质基准值，公式如下：

水生生物急性基准值=LC50(EC50)/AF

水生生物慢性基准值=LOEC/AF

或者，水生生物慢性基准值=LC50(EC50)/(AF ×ACR )

其中，LC50(EC50)和LOEC 分别为最低急性毒性效应数据和最低慢性毒性效应数据；AF 为评价因子，对于非持久性物质，AF 取值为20；对于持久性物质，AF 取值为100；ACR 为急慢性比(acute-to-chronic ratio)[15]。

(2)物种敏感度分布法

利用物种敏感度分布法推导水质基准的步骤如下：

①毒理数据获取：SSD的构建可以使用LC50(或EC50)或NOEC 值等急性或慢性数据。

②SSD曲线拟合：将各物种的毒性数据值由小到大依次排列，然后取其对数值及其对应的累计概率；以浓度的对数值为横坐标、累计概率为纵坐标利用软件作图；选择不同模型拟合SSD曲线。

③HC5值的计算：应用分布模型对应的拟合公式计算出SSD拟合曲线上与5%累积概率相对应的浓度对数，进而计算出对5%的水生生物产生危害的浓度，即为HC5值。

④确定水生生物基准值：急性基准值等于采用水生生物急性毒性数据拟合公式计算出的短期危害浓度(STHC5)除以一个评价因子，评价因子可取值为1～5，本文采用2；慢性基准值等于急性基准值除以最终急慢性比。最终急慢性比(final acute-to-chronic ratio)通过计算各物种的急性慢性比，然后再取几何平均值所得[16]。

(3)毒性百分数排序法

①基准最大浓度(急性基准值)的推导

首先，计算属内平均急性值，属内平均急性值取种内平均急性值的几何平均值；然后，将属内平均急性值从高到低排序，并且给其分配序号R ，最小值的序号为1，最大值的序号是N ，计算累积概率P 公式为P =R /(N +1)；最后，选择4个累积概率最接近0.05的属内平均急性值，根据公式(1)～公式(4)，计算最终急性值[17-18]。

(1)

L=(∑lnGMAV-S∑P)/4

(2)

(3)

FAV =eA

(4)

式中，s 、L 、A 为计算过程中采用的符号，没有特殊含义；GMAV (genus mean acute value)为属内平均急性值；FAV (final acute value)为最终急性值。

将得到的最终急性值除以2，即得到基准最大浓度(急性基准值)，公式如下：

基准最大浓度(急性基准值)=最终急性值/2

②基准连续浓度(慢性基准值)的推导

最终慢性值、最终植物值和最终残留值取最小值即为基准连续浓度。最终慢性值(FCV )：采用基准最大浓度除以最终急慢性比的方法获取基准连续浓度。最终植物值(FPV )：以试验中水生植物毒性试验结果中的最小值作为最终植物值。最终残留值(FRV )：该值的具体计算过程为(1)确定此污染物的最大允许组织浓度(它是有关部门对鱼油、鱼类、贝类的可食用部分的管理水平)；(2)确定此污染物的生物富集系数(通常采用符合要求的数据中的最大值)；(3)按照公式计算此污染物的最终残留值：

FRV =MPTC /BCF

式中，FRV 为最终残留值(mg·L-1)；MTPC 为最大允许组织浓度(mg·kg-1)；BCF 为生物富集系数(L·kg-1)。

2 结果(Results)

2.1 水生生物的毒性试验结果

根据水生生物的毒性试验方法进行毒性试验，得到长江三角洲流域14种代表性水生生物的急性毒性终点值和慢性毒性终点值，结果见表2和表3。

由表2可见，不同水生生物急性毒性终点值差别较大。百菌清对有些生物毒性非常高，大乳头水螅96 h-LC50值为0.00132 mg·L-1，对有些生物毒性较低，长江华溪蟹48 h-LC50为366.0 mg·L-1。

表2 百菌清对长江三角洲流域水生生物的急性毒性试验结果Table 2 The acute toxicity data of chlorothalonil to aquatic life in the Yangtze River Delta Region

表3 百菌清对长江三角洲流域水生生物的慢性毒性试验结果Table 3 The chronic toxicity data of chlorothalonil to aquatic life in the Yangtze River Delta Region

2.2 不同方法推导的水生生物基准值2.2.1 评价因子法

急性基准值推导：由表2可以看出，在所有受试生物中，大乳头水螅对百菌清最敏感，其96 h-LC50为0.00132 mg·L-1，百菌清属于非持久性污染物，因此，选择20作为评价因子，百菌清水生生物急性基准值为0.066 μ g·L-1。

慢性基准值推导：采用水生生物急性基准值除以最终急性慢性比推导百菌清水生生物慢性基准值。最终急慢性比的计算选择大型溞、黄颡鱼和斑马鱼的急性毒性终点EC50或LC50除以慢性毒性终点NOEC，得到各物种的急慢性比，然后取三者的几何平均值。百菌清最终急慢性比计算结果见表4。计算得出的百菌清水生生物慢性基准值为0.0089 μg·L-1。

2.2.2 物种敏感度分布法

急性基准值推导：首先，计算各物种的毒性数据的对数值和对应的累积概率，见表5。

表4 百菌清最终急慢性比Table 4 The final acute-to-chronic toxicity ratio of chlorothalonil

表5 百菌清的种内平均急性值及其对应的累积概率Table 5 The species mean acute values and cumulative probability of chlorothalonil to aquatic life

图1 不同模型拟合的水生生物对百菌清的敏感度分布曲线

然后对物种毒性数据的对数值和对应的累积概率进行对数正态分布检验(Shapiro-Wilk检验)，所得的显著性水平P =0.308，在0.05和0.95之间，显示数据符合对数正态分布，选择合适的模型进行拟合，拟合结果见图1。

图1显示的是采用sigmoid 3参数、sigmoid 4参数、Gompertz、Gaussian模型拟合的物种敏感度分布曲线，由相关系数R 可以看出，Gompertz模型的拟合度最高，其相关系数R 为0.9912。因此，采用Gompertz模型得出的5.9947 μg·L-1作为百菌清的5%短期危害浓度(STHC5)，因为急性基准值等于STHC5除以2。所以，百菌清水生生物急性基准值为3.00 μg·L-1。

慢性基准值推导：采用水生生物急性基准值除以最终急性慢性比的方法获取慢性基准值。由表4可知，最终急慢性比为7.42，因此计算得出的百菌清水生生物慢性基准值为0.40 μg·L-1。

2.2.3 毒性百分数排序法

基准最大浓度(急性基准值)推导：根据百菌清对长江三角洲流域水生生物的急性毒性数据，计算各物种的属内平均急性值及其对应的累积概率，然后选择4个累积概率最接近0.05的属内平均急性值(表6)，计算最终急性值。

将所需数据代入公式(1)～(4)，计算出最终急性值为1.01 μg·L-1，将得到的最终急性值除以2，得到百菌清基准最大浓度(急性基准值)为0.51 μ g·L-1。

基准连续浓度(慢性基准值)推导：根据毒性百分数排序法，最终慢性值、最终植物值和最终残留值三者中的最小值即为基准连续浓度。采用基准最大浓度除以最终急慢性比的方法获取最终慢性值。最终急慢性比为7.42，最终慢性值为0.136 μg·L-1。由百菌清对蛋白核小球藻、紫萍和浮萍的毒性试验结果(表2)可见，蛋白核小球藻对百菌清最敏感，72 h-EC50为0.24 mg·L-1，因此百菌清最终植物值为0.24mg·L-1。因为百菌清生物蓄积性较低，所以可不考虑其残留值。因此，百菌清基准连续浓度取最终慢性值和最终植物值中的最小者，百菌清基准连续浓度为0.136 μg·L-1。

表6 累积概率最接近0.05的4个属的基本信息Table 6 The basic information of four genus of the cumulative probability closest to 0.05

3 讨论(Discussion)

本研究在开展百菌清对长江三角洲流域14种代表性水生生物急性毒性和3种水生生物慢性毒性的基础上，分别采用评价因子法、物种敏感度分布法和毒性百分数排序法推导了百菌清的水生生物急性和慢性基准值，结果见表7。

表7 不同推导方法得到的百菌清水生生物基准值Table 7 The derived aquatic life criteria for chlorothalonil by different derivation methods

由表7可以看出，评价因子法得到的基准值显著低于另外2种方法得到的基准值。这是由于评价因子法是基于最敏感物种的毒性数据来推导的基准值，从生态系统整体来看，该方法获得的基准值可能会造成“过保护”或“欠保护”。但该方法简单易行，在毒性数据较少的情况下，仍然需要通过该方法推导水生生物基准值[19-20]。

采用物种敏感度分布法与毒性百分数排序法推导的基准值比较接近，但毒性百分数排序法推导的基准值略低，这是由于毒性百分数排序法在推导水生生物基准时，最终只采用最敏感的4个属(鲫属、陆蛙属、蟾蜍属、水螅属)的急性毒性数据，这可能是造成毒性百分数排序法推导的基准略低于物种敏感度分布法推导的基准值的重要原因。另外，毒性百分数排序法将物种按照生物学进行分类，更符合自然界物种的实际分布，同时也考虑了生物富集作用，并且有较严格的公式推导水生生物基准值，显示出毒性百分数排序法的优点。物种敏感度分布法具有一定的数理统计支持，对毒性数据进行了统计检验，满足一个概率分布的有限物种的评估可以代表整个生态系统，说明此方法推导出的基准值也较有说服力。为了充分地保护长江三角洲流域水生生态系统，选取2种推导方法得到的较低值作为百菌清的推荐基准值。因此，将选取采用毒性百分数排序法得出的基准值作为我国百菌清的推荐基准值，即百菌清对水生生物的急性基准值为0.51 μ g·L-1，慢性基准值为0.136 μg·L-1。

对于百菌清国外基准值的调研显示，只有加拿大制定了百菌清的基准值，其采用物种敏感度分布法获得的慢性基准值为0.18 μg·L-1，本研究采用物种敏感度分布法获得的慢性基准值为0.40 μg·L-1，采用毒性百分数排序法获得的慢性基准值为0.136 μg·L-1。可以看出，3个数值略有不同。数值差异可能是由于我国与加拿大的水生生态系统和生物区系特征不同。因为水生态系统和生物的区系特征直接影响水生生物基准。但3个基准值非常接近，也反映出本研究结果与国外研究结果的一致性。

此外，我国现行《地表水环境质量标准》(GB3838—2002)在“集中式生活饮用水地表水源地特定项目标准限值”中规定百菌清的标准限值为0.01 mg·L-1，远高于本研究推导出的百菌清水生生物基准值，此标准值已不足以保护我国水生生物及水生生态系统，需要对标准值加以修订。希望本研究结果可为今后我国地表水环境质量标准的制修订提供科学依据。

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Aquatic Life Criteria for Chlorothalonil in the Yangtze River Delta Region of China

Zhou Junying1,*, Wang Xianglan2, Liang Xia1, Sun Hongying3, Ge Feng1

1. Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China 2. DNA Detection Center of Huaiyin Branch of Huaian Municipal Public Security Bureau, Huaian 223300, China 3. College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China

The toxicity data of 14 representative aquatic life was obtained through the ecological toxicity tests. The aquatic life criteria for chlorothalonil in the Yangtze River Delta Region were derived by Assessment Factor, Species Sensitivity Distributions and Toxicity Percentile Rank respectively. The acute aquatic life criteria of chlorothalonil derived by Assessment Factor, Species Sensitivity Distributions and Toxicity Percentile Rank were 0.066 μg·L-1, 3.00 μg·L-1and 0.51 μg·L-1; the chronic aquatic life criteria were 0.0089 μg·L-1, 0.40 μg·L-1and 0.136 μg·L-1, respectively. The differences of the criteria which were derived from three methods were compared and the reasons were analyzed. Then, the recommended aquatic life criteria for chlorothalonil in the Yangtze River Delta Region were proposed, and the recommended criteria were compared with criteria of other countries. The results could provide scientific basis for development and revision of the water quality standards and the aquatic risk assessment in China.

chlorothalonil; aquatic life; criteria; the Yangtze River Delta Region

环保公益项目“地表水环境质量农药生态基准预研究”(201009033)；国家环境保护标准项目“农药生态风险评价程序与方法”(2014-72)

周军英(1966-)，女，研究员，研究方向为生态毒理学、环境基准标准及风险评估，E-mail: zjy@nies.org；

10.7524/AJE.1673-5897.20150715003

2015-07-15录用日期：2015-10-12

1673-5897(2015)5-141-9

X171.5

A

周军英，王香兰，梁霞, 等. 中国长江三角洲流域百菌清水生生物基准研究[J]. 生态毒理学报，2015, 10(5): 141-149

Zhou J Y, Wang X L, Liang X, et al. Aquatic life criteria for chlorothalonil in the Yangtze River Delta Region of China [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 141-149 (in Chinese)