城市社区农贸市场空气微生物及抗生素抗性基因研究

房文艳，高新磊，李继，董玉芳，曹罡，邵明非,*，宋江玉

1． 哈尔滨工业大学深圳研究生院 深圳市水资源利用与环境污染控制重点实验室，深圳 518055 2． 中石化宁波工程有限公司，宁波 315103 3． 郑州大学综合设计研究院有限公司，郑州 450000

城市社区农贸市场空气微生物及抗生素抗性基因研究

房文艳1，高新磊1，李继1，董玉芳2，曹罡1，邵明非1,*，宋江玉3

1． 哈尔滨工业大学深圳研究生院 深圳市水资源利用与环境污染控制重点实验室，深圳 518055 2． 中石化宁波工程有限公司，宁波 315103 3． 郑州大学综合设计研究院有限公司，郑州 450000

社区农贸市场活禽交易区是城市重要的人畜交叉感染区域，区内高存量的微生物和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)可通过粪便、冲洗水、空气等介质传播扩散。而空气介质中通过微生物气溶胶形式的传播途径，因其隐秘性、持久性的特点而对社区居民健康构成严重威胁。本文研究了深圳市某典型社区农贸市场内空气微生物及抗生素抗性基因。结果表明，活禽交易区可培养细菌浓度高达105CFU·m-3，远高于一般室内区域(103CFU·m-3)，其中PM2.5精细颗粒物(0.65～3.3 μm)中所含菌量占总菌量42%以上；活禽交易区空气介质中，抗生素抗性基因tetG、tetW、sul1和sul2检出率达70%以上，其绝对浓度在 104～109copies·m-3之间；周边环境空气样品中，随着与活禽交易区距离的增加，空气微生物及抗生素抗性基因含量呈显著下降趋势。结果表明，农贸市场活禽交易区是微生物和抗生素抗性基因的一个重要储存库，活禽交易区空气会严重影响农贸市场及其外周边空气质量。

微生物气溶胶；抗生素抗性基因；社区农贸市场

社区农贸市场活禽交易区是城市重要的人畜交叉感染区域。区内禽类密度大，空间狭小封闭，空气流动性差，禽类可通过粪便排出细菌和病毒[1]，逸散进入空气极易形成微生物气溶胶，并且微生物气溶胶可借助空气介质传输和扩散[2]，其中含有的病原菌和抗生素抗性基因会带来环境污染，给动物体和人类健康造成潜在威胁[3-4]。

针对微生物气溶胶污染，研究者采用基于培养的方式在校园、养殖场、污水处理厂等场所进行了大量研究[5-7]。其中，钟召兵和王宁[2]研究了养殖环境微生物的气溶胶粒径分布并评估了其健康危害，研究显示鸡舍每天约有6.1×105CFU气载细菌可进入人和动物小支气管并直接进入肺泡。随着兽用抗生素在养殖业的广泛应用，畜禽粪便[8]、畜禽养殖环境空气介质[9]中广泛存在的抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs，以下简称“抗性基因”)也日益受到关注[10]。Sapkota等[11]在养殖场空气气溶胶中检测到抗性基因，所有筛选的具有多重抗性的菌株中均含有大环内酯类抗性基因ermA、ermB、ermC、ermF和mefA；Alison等[12]研究了养殖场空气气溶胶中四环素类ARGs和I类整合子基因，认为养殖场空气是多重抗性的存储库。另有研究在养殖场空气中检出了四环素类ARGs(tetA、tetC、tetO、tetW等)[13-14]。

社区农贸市场活禽交易区为人禽频繁接触的区域，区内微生物和抗性基因污染问题不应忽视。目前国内仅有少量针对城市社区农贸市场空气微生物污染状况的研究[15]，而对农贸市场空气介质抗性基因污染研究更是少见报道。为全面了解城市社区农贸市场空气微生物和抗性基因污染状况，本研究选取深圳市某典型城市社区农贸市场作为研究对象，采用基于培养的方法调查其细菌气溶胶污染状况；选用农贸市场内可能存在的四环素类(tetG、tetM)和磺胺类(sul1、sul2)共4种抗性基因，采用非基于培养的方法研究其在农贸市场及周边环境的空气污染状况。本研究旨在阐明城市农贸市场空气介质中微生物气溶胶及抗性基因污染特征，并为政府部门制定农贸市场活禽区管理措施提供理论依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

选取深圳市南山区平山农贸市场作为典型城市社区级农贸市场，该市场占地600 m2，人流量日均650人次，活禽区活禽交易量日均200只。空气样品分别采集自农贸市场活禽区、一般区域(蔬菜区、肉类区等)和市场外10 m、100 m和400 m处。并采集一般人流密集区(深圳市某医院输液区)、一般室内环境(大学实验室)、医疗洁净环境(深圳市某医院新生儿科)的空气样本作为分析对照。

1.2 实验方法

1.2.1 采样方法

可培养的空气微生物采用安德森六级撞击式空气微生物采样仪(FA-1型，辽宁，辽阳市康洁仪器研究所)采集，各级捕获粒子粒径分布分别为0.65～1.1 μm、1.1～2.1 μm、2.1～3.3 μm、3.3～4.7 μm、4.7～7.0 μm、 >7.0 μm，选用LB固体培养基，采样高度1.5 m，流量为28.3 L·min-1，采样时间根据不同的环境采集1～10 min不等。采样后及时置于37 ℃培养16 h，再在各级采样皿上进行菌落计数。

空气微生物样品选用智能大流量TSP(PM10)采样器(2031型，山东，青岛崂山应用技术)采集，使用230 mm×180 mm玻璃纤维膜，流量为1.05 m3·min-1，时间4～24 h，采样结束后取采样膜面积的1/8(约52 cm2)，采用Fast DNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals)提取空气样品DNA。

1.2.2 抗生素抗性基因分析方法

分别选择tetG和tetW两种四环素抗性基因以及sul1和sul2两种磺胺抗性基因进行分析：采用PCR技术检测4种抗性基因在空气样品中的检出率，采用qPCR技术定量4种抗性基因的浓度。

空气样品内抗性基因浓度定量方法采用公式con(ARGs) = A×B×C，con(ARGs)表示单位空气抗性基因含量(copies·m-3)，其中A表示单位空气细菌总数(cell·m-3)，将大流量采样器采集的滤膜经DAPI染色后使用荧光显微镜计数定量获得；B表示单位细菌平均DNA含量(4.23×10-6ng·cell-1)[16]；C表示单位DNA抗性基因含量(copies·ng-1DNA)，通过qPCR实验可得到[17]。

2 结果(Results)

2.1 农贸市场及周边环境空气微生物污染特征

以空气微生物清洁评价标准[18-19]作为参照(虚线所示)，农贸市场活禽区、市场内一般区域和市场外10 m、100 m、400 m处空气中细菌浓度分布结果见图1。

图1 农贸市场内外各采样点细菌浓度分布

从图1中可看出，农贸市场内外部不同区域细菌浓度水平有较大差异。农贸市场内部活禽区细菌浓度最高，可达105CFU·m-3，高于农贸市场内一般区域(104CFU·m-3)，并高出一般人流密集区(深圳市某医院输液区)2个数量级(103CFU·m-3)。农贸市场内细菌浓度超出空气微生物评价清洁标准1～2个数量级，同时在距市场10 m、100 m、400 m的农贸市场环境空气中，细菌浓度随离农贸市场距离的增加而降低。

由农贸市场内部及周边环境细菌气溶胶粒径分布(图2)可知，农贸市场活禽区空气细菌气溶胶粒径多集中在2.1～7.0 μm范围内，而市场内一般区域及市场周围环境细菌气溶胶粒径主要分布在1.1～4.7 μm。各不同区域采样点PM2.5(粒径范围为0.65 ～ 3.3 μm)(stage 4, stage 5, stage 6)精细颗粒物粒径范围内细菌气溶胶浓度占全部浓度的比例依次为42.6%、58.2%、66.2%、60.2%、61.4%和57.9%。

图2 农贸市场内部及周边环境细菌气溶胶粒径分布

2.2 农贸市场及周边环境抗性基因污染特征

农贸市场内部空气细菌气溶胶污染较市场外环境空气严重，显示出其作为微生物污染源的属性。为更进一步研究农贸市场空气介质抗性基因污染状况，采用非基于培养的方式对抗性基因tetG、tetW、sul1、sul2污染进行定性定量分析。结果表明，在农贸市场及周边环境所有采集的空气样品中4种抗性基因均有检出，其中tetW的检出率为71.4%，tetG、sul1和sul2的检出率达到100%。各采样点空气样品抗性基因的绝对定量结果如图3所示。

图3 农贸市场及周边环境空气介质抗生素抗性基因绝对浓度

由图3可看出，在农贸市场及周边环境的空气样品中，4种抗性基因的绝对含量在102～109copies·m-3范围内。其中活禽区4种抗性基因的绝对含量显著高于其余样品；随着与活禽区距离的增加，4种抗性基因的浓度均呈下降趋势。

3 讨论(Discussion)

城市社区农贸市场人员活动密集，活禽交易区内活禽成为微生物气溶胶污染的重要源头，国内外对农贸市场微生物气溶胶和抗性基因污染状况研究较少且较为局限。叶锦韶等[15]研究了广州市部分菜市场空气的微生物污染状况，结果表明活禽区细菌总数(95～15 000 CFU/皿)明显高于GB9670—1996《商场(店)、书店卫生标准》[18]中细菌总数的规定限值(75 CFU/皿)，且市场内空气微生物以活禽区为中心向外扩散传播。本研究结果显示农贸市场活禽区细菌浓度为105CFU·m-3，高出中国科学院制定的空气微生物评价标准[19-20]中的标准清洁水平(1.0×103CFU·m-3)2个数量级，达到极严重污染水平(4.5×104CFU·m-3)。同时细菌气溶胶污染程度具有以活禽区为中心向外围环境扩散的趋势，在农贸市场外10 m处的污染水平(2.3×103CFU·m-3已基本接近清洁标准。这与叶锦韶等[15]的活禽区细菌气溶胶污染的研究结果较为一致。这可能是因为农贸市场内活禽通过粪便及排泄物逸散形成微生物气溶胶[21-22]，而市场内空气流动性较差，导致细菌气溶胶扩散慢、浓度高。在市场外，因空气对流快，细菌气溶胶逸散较快。对气溶胶粒径分布的研究结果显示，农贸市场活禽区细菌气溶胶较均匀分布在各级，其中PM2.5(粒径范围0.65～3.3 μm)细菌气溶胶比例达42%，此粒径范围内的细菌气溶胶可进入人体气管与支气管或直接进入肺泡，存在引起呼吸道感染的风险[6]。

本文对农贸市场及周边环境空气样品中可能含有的四环素类(tetG、tetM)、磺胺类(sul1、sul2)ARGs进行定量研究，结果表明农贸市场内活禽区4种抗性基因污染最为严重，且4种抗性基因的绝对含量随着离活禽区距离的增加逐渐递减，其中tetG在活禽区浓度(7.07×109copies·m-3)最高，而市场内一般区域(7.45×103copies·m-3)浓度迅速降低。研究结果与Gibbs等[23]报道的结果一致，即距养殖场下风向距离增加，抗性细菌浓度降低。相较于一般室内环境(大学实验室)空气，农贸市场活禽区抗性基因污染严重，平均高于前者4～5个数量级，且有向外围空间扩散的趋向，提示农贸市场活禽区是抗性基因一个重要的潜在储存库。

在对农贸市场及其周边环境空气微生物及抗性基因污染状况的研究中发现，农贸市场的污染状况较周边环境严重，而活禽区是农贸市场内污染最为严重的区域。随着与活禽区距离的增加，细菌气溶胶及抗性基因污染状况均呈现逐渐递减的趋势。可见农贸市场活禽区是细菌气溶胶和抗性基因的潜在储存库，影响农贸市场及周边环境空气质量。

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◆

Investigation on Airborne Bacteria and Antibiotic Resistance Genes in Urban Community Farmers Market

Fang Wenyan1, Gao Xinlei1, Li Ji1, Dong Yufang2, Cao Gang1, Shao Mingfei1,*, Song Jiangyu3

1. Harbin Institute of Technology Shenzhen Graduate School, Shenzhen Key Laboratory of Water Resource Utilization and Environmental Pollution Control, Shenzhen 518055, China 2. Sinopec Ningbo Engineering Co. Ltd, Ningbo 315103, China 3. Zhengzhou University Multi-functional Design and Research Academy Limited Company, Zhengzhou 450000, China

Received 28 May 2015 accepted 24 August 2015

The live poultry trading zones in urban community farmers markets are important across-infection areas between human and animals, where large amounts of bacteria and antibiotics resistance genes (ARGs) can be spread by manure, rinse water and air. The dissemination through the microbial aerosol in air, due to the characteristics of concealment and persistence, poses a serious threat to public health. This paper studies the bacteria and ARGs in the ambient air of a typical urban community farmers market in Shenzhen. The results show that the concentration of culturable bacteria is up to 105CFU·m-3in the live poultry trading zone, which is much higher than that found in general indoor area (103CFU·m-3). The bacteria content in PM2.5account for above 42% of the total bacteria content. The positive detection rates of ARGs including tetG, tetW, sul1 and sul2 in the air of the live poultry trading zone are above 70% and the absolute ARGs concentrations range from 104to 109copies·m-3. The concentrations of airborne bacteria and ARGs in ambient air decrease significantly with the increase in distance from the live poultry trading zone, suggesting that the live poultry trading zone in urban community farmers market is an important reservoir for the bacteria and ARGs, which affects the air quality of the market and its surroundings seriously.

microbial aerosols; ARGs; urban community farmers market

环保公益性行业科研专项(201309031)；国家自然科学基金(31200104)；深圳市基础研究计划(JCYJ20120613154350967)

房文艳(1990-)，女，硕士研究生，研究方向为环境管理，E-mail: fwyyouxiang@163.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: mfshao@hitsz.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150528007

2015-05-28录用日期：2015-08-24

1673-5897(2015)5-095-05

X171.5

A

邵明非(1979-)，男，香港大学博士，助理教授，主要研究方向为基于宏基因组学的微生物生态研究；环境工程微生物技术；污染海域碳、硫、氮、磷地质化学循环及相关微生物过程；抗生素耐药微生物及耐药基因。

房文艳, 高新磊, 李继, 等. 城市社区农贸市场空气微生物及抗生素抗性基因研究[J]. 生态毒理学报，2015, 10(5): 95-99

Fang W Y, Gao X L, Li J, et al. Investigation on airborne bacteria and antibiotic resistance genes in urban community farmers market [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 95-99 (in Chinese)