CD4＋CD25＋FOXP3＋调节性T细胞和PD－1＋CD4＋T细胞对宫颈内皮细胞瘤预后的作用

李秀玉，胡 波，李忠新

（1．深圳市中医院检验科，广东深圳518000；2．中山大学附属第三医院检验科，广州510630）

宫颈皮内细胞瘤（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是一组宫颈病变的统称，包括宫颈不典型增生和原位癌，为宫颈浸润癌的癌前期病变。病理上通常将CIN分为3级，CINⅠ级指轻度不典型增生，CINⅡ级指中度不典型增生，CINⅢ级指重度不典型增生及原位癌［1－2］。其主要病因是人乳头瘤状病毒（HPV）的感染，但70%以上HPV感染并不导致宫颈损害。可能原因包括招募调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）、髓样来源的抑制细胞（myeloid－derived suppressor cells，MDSCs）和抑制性细胞因子的局部分泌，如IL－10、TGF－β，导致免疫效应细胞的钝化或失活。此外，体内T细胞被激活后诱导产生抑制性受体如PD－1、CTLA－4，这些抑制性受体被称为免疫检查点（immune checkpoint）。它们在正常生理条件下能保护机体免受免疫损伤或对自身抗原耐受。在慢性病毒性感染或肿瘤患者体内存在T细胞功能耗损，主要是因为PD－1表达增多［3－5］。本研究观察宫颈局部的CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs和PD－1＋CD4＋T细胞在CIN转归中的作用，为了解CIN的病理和预后提供依据。

1 材料和方法

1．1 主要试剂与材料 RPMI－1640培养基、10%胎牛血清购自杭州四季青生物公司，两性霉素B、肝素购自Sigma公司，FITC－anti－PD－1、PC5．5－anti－CD4、APC－anti－CD25 购 自 Santa Cruz公司，40%Percoll液购自达科为生物公司；全新贝克曼CytoFLEX流式细胞仪。

1．2 方法

1．2．1 宫颈细胞样品的收集 细胞刷收集36例病理诊断为CIN患者的宫颈细胞样品。本研究得到了本院伦理委员会同意，所有患者均签署知情同意书。病例排除有症状的阴道炎或性病。36例CIN患者被分为宫颈细胞学检查消退的CIN患者和未消退的患者。在本研究中，细胞学上的消退被定义为连续2次间隔3～4个月检测细胞学病理正常。其中18名患者为消退组，平均随访时间为16．5个月。另外18名为未消退组，作为对照，平均随访时间为19．0个月。收集每个患者的吸烟史和月经情况。

1．2．2 宫颈淋巴细胞的收集和处理 按照文献［6］用Digene细胞刷收集细胞。细胞刷插进宫颈，旋转几次。把细胞刷立即放入装入RPMI－1640培养基中［含10%胎牛血清、100mg／mL和2．5μg／mL 两性霉素 B、抗凝 剂 （0．1IU／mL 肝素 和 8 nmol／L EDTA）］的试管中。把样品放进含5mmol／L DL－二硫苏糖醇中在37℃震动孵育15min，取出细胞刷。试管以330×g离心4min。然后用40%Percoll液10mL重悬细胞。混合物用70%Percoll液分层，480×g离心18min。单个核细胞分布在Percoll界面，吸取这些细胞，用PBS洗涤。细胞活性大于95%，新鲜的样品立即用于后续的分析。

1．2．3 免疫标记和流式细胞仪分析 采用荧光标记的抗体检测宫颈淋巴细胞表面抗原，包括 FITC－anti－PD－1，PC5．5－anti－CD4，APC－anti－CD25（Santa Cruz公司）。与抗体孵育后，细胞用 FACS 缓 冲 液 （10%FCS，1mmol／L EDTA，10mmol／L NaN3）洗2次，FOXP3固定／渗透工作液渗透，抗细胞内抗原抗体免疫PE－anti－Foxp3标记，流式细胞染色缓冲液冲洗细胞2次，用流式细胞染色缓冲液重悬细胞，同型抗体作为对照。每个样品至少分析5 000个宫颈淋巴细胞，用流式细胞分析软件分析。

1．2．4 HPV基因分型 HPV的基因分型委托金域医学检验中心（广州）完成，在本研究中24名患者的病毒学检查见表1。根据国际癌症研究署 HPVs 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、68、73、82被定义为高危型 HPV。

1．3 统计学处理 本研究采用JMP®软件进行数据分析，计量资料用x±s表示，Wilcoxon rank sum tests或Fisher′s检验用于配对比较分析。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 在CIN皮损处分离宫颈耐受T细胞亚群 宫颈淋巴细胞从位于Percoll和培养基中间相分离得到［3］。CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs或PD－1＋CD4＋T细胞通过流式细胞仪分析（图1）。宫颈CD4＋CD25＋FOXP3＋占14．2%，而 PD－1＋CD4＋T细胞占33．6%。在所有的CIN患者中，CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs的均值为11．8% （IQR：7．2～14．6，n＝36），而 PD－1＋CD4＋T细胞的比例为30．3% （IQR：20．2～38．4，n＝36）。

2．2 HPV基因型分布 36例中有6人多重感染；结果表明在宫颈内皮细胞瘤中HPV感染的基因型主要以HPV16，HPV52，HPV58和HPV45多见。见表1。2．3 CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs和 PD－1＋CD4＋T 细胞和CIN之间的关系 所有患者在登记时被诊断CINⅠ、Ⅱ，随后每4个月用阴道镜和宫颈细胞涂片检查随访，比较位于CIN消退和未消退（各18名）皮损处的CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs和PD－1＋CD4＋T细胞群，以确定是否宫颈耐受性T细胞亚群和CIN消退之间的相关性。18名CIN消退患者，平均持续时间为16．5（8～33）月。18名未消退患者持续性细胞学异常。消退组与未消退组高危型 HPV感染的检出率（58．3%vs．83．3%，P＝0．37），CINⅡ的百分率（33．6%vs．58．2%，P＝0．40）和平均年龄（32岁vs．38岁，P＝0．44）差异无统计学意义。在消退组，宫颈CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs平均为7．3%（IQR：6．3～11．4），而未消退组宫颈 CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs平均为13．9% （IQR：11．6～16．9），前者显著低于后者（P＝0．001 2）。消退组宫颈PD1＋CD4＋T细胞平均为20．8%（IQR：15．8～31．9），而未消退组宫颈PD1＋CD4＋T细胞平均为35．1% （IQR：30．2～42．6），前者显著低于后者 （P＝0．017）。1例CIN患者宫颈皮损处分离的免疫细胞流式细胞仪分析的结果见图1。

表1 患者感染HPV基因型的人数（n）

图1 1例CIN患者宫颈皮损处分离的免疫细胞流式细胞仪分析的结果

3 讨 论

CIN是宫颈癌的癌前病理损伤，与HPV感染密切相关。但70%以上的HPV感染者是一过性感染，仅少数发展成CIN，最后进展成宫颈癌。这表明除了HPV感染因素外，其他因素特别是宿主的免疫反应在宫颈癌的进展中也起重要作用。尽管一些研究报道抑制性淋巴细胞和肿瘤预后差成正相关，在肿瘤组织内CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs的表达增加和PD－1＋CD4＋T细胞的增加常常表明预后较差，用PD－1单克隆抗体可以阻断PD－1的信号途径治疗肿瘤。但是CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs和PD－1＋CD4＋T细胞在 HPV－感染相关的宫颈前期损伤的资料不多。本研究结果显示位于宫颈前期损伤部位的 CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs和PD1＋CD4＋T细胞与CIN的自发消退呈负相关。

外周血CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs包括天然调节性T细胞（nTregs）和诱导性调节性T细胞（iTregs）。iTregs在黏膜耐受、对严重的慢性过敏性炎症以及微生物的预防和肿瘤的监视方面起关键作用，而nTregs则在阻止自身免疫和加重免疫反应方面起重要作用［7－9］。在本研究中，作者预测宫颈CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs多数是iTregs。因为缺乏合适的表面标记区分iTregs和nTregs细胞群，导致分离iTregs困难。

本研究结果还显示宫颈皮损处CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs与CIN的消退成负相关，但与CIN的分级没有明显相关性（资料没有显示）。宫颈iTregs和循环的Tregs的TCR库可能不同。已知iTregs通过黏膜相关的DC分泌TGF－β，从而导致成熟的处女CD4＋细胞分化成iTregs。整个宫颈淋巴细胞的CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs的比例（平均11%）是外周血（约5%）的2倍。这表明iTregs可能以抗原－依赖的方式连续产生，于是在慢性HPV感染的组织和CIN皮损处累积。有报道称在宫颈样品中，包括已脱落的上皮细胞和宫颈淋巴细胞在高级别鳞状内皮损伤（HSIL）患者较低级别的鳞状上皮损伤（LSIL）中 的 FOXP3mRNA 高［10］。 但 是，FOXP3mRNA 与Tregs的数量平行仍不清楚，因为宫颈淋巴细胞非特异性分离。据报道CD4＋CD25＋Treg的频率与HPV16感染的持续性相关［11－12］。但在本研究中，作者无法了解CIN患者HPV的感染时间。此外Treg可能抑制免疫细胞清除HPV感染的细胞。

TGF－β对诱导和维持CD4＋CD25＋FOXP3＋Treg非常关键，特别是在处女CD4＋细胞向iTregs的诱导和效应T细胞向iTregs的转化中很重要。几个研究已经证明了在宫颈样本中TGF－β和维甲酸（RA）受体的表达在 CIN 皮损处降低［13－15］。在这些研究中，TGF－βmRNA水平与CIN分级或CIN的自然病程不相关。TGF－β诱导的iTregs水平较TGF－β更直接指示CIN进展。事实上，在CIN皮损处检测抑制性T细胞水平可以判断预后。

在本研究中，作者主要研究PD－1＋CD4＋T细胞和CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs，因为T细胞的PD－1对于处女CD4＋细胞分化成CD4＋CD25＋Foxp3＋iTregs非常关键。而且，Tregs和PD－1／PD－L途径的整合决定免疫反应的终止和提高对抗肿瘤T细胞反应的抑制。PD－1途径控制黏膜部位iTregs的发育、维持和功能。本研究结果显示PD－1＋CD4＋T细胞在宫颈淋巴细胞较外周血多，CIN皮损处的PD1＋CD4＋T细胞的比例与CIN自发消退成负相关。至于其他耐受性T细胞亚群因受到获取的淋巴细胞数量的限制而未被研究。

作者的研究存在一定的局限性，主要是标本量少，只有36个病例，HPV感染的类型多，且有多个型别的HPV感染，获取宫颈淋巴细胞数量受限。但作者的流式细胞仪分析证明了CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs侵润至CIN皮损处，与CIN的消退显著相关，与感染的HPV亚型无关。相反地，皮损处宫颈CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs的高发生率可能负责CIN的持续性，可作为CIN进展的标记物。

［1］Insinga RP，Perez G，Wheeler CM，et al．Incident cervical HPV infections in young women：transition probabilities for CIN and infection clearance［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2011，20（2）：287－296．

［2］ Konno R，Tamura S，Dobbelaere K，et al．Prevalence and type distribution of human papillomavirus in healthy Japanese women aged 20to 25years old enrolled in a clinical study［J］．Cancer Sci，2011，102（4）：877－882．

［3］ Pardoll DM．The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy［J］．Nat Rev Cancer，2012，12（4）：252－264．

［4］ Lindsay CR，Spiliopoulou P，Waterston A．Blinded by the light：why the treatment of metastatic melanoma has created a new paradigm for the management of cancer［J］．T－her Adv Med Oncol，2015，7（2）：107－121．

［5］ Gubin MM，Zhang X，Schuster H，et al．Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour－specific mutant antigens［J］．Nature，2014，515（7528）：577－581．

［6］ Kojima S，Kawanna K，Fujii T．et al characterization of Gut－Derived intraepithelial lymphocyte（IEL）residing in human papillomavirus（HPV）－Infected intraepithelial neoplastic lesions［J］．Am J Reprod Immunol，2011，66（5）：435－443．

［7］ Maria A，Lafaille C，Lafaille JJ．Natural and adaptive Foxp3＋regulatory T cells：more of the same or a division of labor［J］．Immunity，2009，30（5）：626－635．

［8］ Chaudhary B，Elkord E．Downregulation of immunosuppressive environment in patients with chronic HBV hepatitis on maintained remission［J］．Front Immunol，2015；6：52．

［9］ Zhang M，Zhou J，Zhao T，et al．Dissection of a circulating and intrahepatic CD4（＋）Foxp3（＋）T－cell subpopulation in chronic hepatitis B virus（HBV）infection：a highly informative strategy for distinguishing chronic HBV infection states［J］．J Infect Dis，2012，205（7）：1111－1120．

［10］Scott ME，Ma Y，Kuzmich L，et al．Diminished IFN－gamma and IL－10and elevated Foxp3mRNA expression in the cervix are associated with CIN 2or 3［J］．Int J Cancer，2009，124（6）：1379－1383．

［11］Molling JW，De Gruijl TD，Glim J，et al．CD4（＋）CD25（hi）regulatory T－cell frequency correlates with persistence of human papillomavirus type 16and T helper cell responses in patients with cervical intraepithelial neoplasia［J］．Int J Cancer，2007，121（8）：1749－1755．

［12］Rosales R，Rosales C．Immune therapy for human papillomaviruses－related cancers［J］．World J Clin Oncol，2014，5（5）：1002－1019．

［13］Torres－Poveda K，Bahena－Román M，Madrid－González C，et al．Role of IL－10and TGF－β1in local immunosuppression in HPV－associated cervical neoplasia［J］．World J Clin Oncol，2014，5（4）：753－763．

［14］Guan X，Sturgis EM，Lei D，et al．Association of TGF－beta1genetic variants with HPV16－positive oropharyngeal cancer［J］．Clin Cancer Res，2010，16（5）：1416－1422．

［15］Gómez－Gómez Y，Organista－Nava J，Gariglio P．Deregulation of the miRNAs expression in cervical cancer：human papillomavirus implications［J］．Biomed Res Int，2013，2013：407052．