育真熄风汤对拟帕金森小鼠脑内nNOS和iNOS的影响＊

卢思英，党晓伟，李 建，张世琴，秦博文，商亚珍

（1．河北承德护理职业学院，河北承德067000；2．河北承德医学院中药研究所，河北承德067000）

帕金森病（PD）是世界卫生组织确定的疑难疾病之一。研究表明，一氧化氮（NO）作为中枢神经系统内的细胞递质和信使分子，参与了帕金森等神经退行性疾病的病理过程。而一氧化氮合酶（NOS）作为NO生成的关键限速酶，可间接反映NO对DA神经元的影响。自拟配方育真熄风汤（Yuzhenxifeng decoction，YZXFD）在临床中应用多年，但其作用机理一直未有研究。本实验目的希望通过动物实验，研究其对PD小鼠脑内神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的影响，探讨中药复方YZXFD对帕金森病的作用机理。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验动物 采用C57／BL健康雄性小鼠90只，6～7周龄，SPF级，体质量18～20g。购于北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号为SCXK京2009－2004。

1．1．2 仪器与试剂 BH－2型OLYMPUS显微镜及摄像装置（日本），美多巴（每片含苄丝肼50mg＋左旋多巴200mg，上海，罗氏公司），MPTP（1－methyl－4－pheny－1，2，3，6－tetrahydropyridine，美国，Sigma公司），兔抗小鼠nNOS抗体、iNOS抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。

1．1．3 药物制备 中药配方YZXFD以生黄芪、熟地、龟板为君药，包含多种中药成分［1］，生药总量275g制成中药汤剂。根据药理学方法制成高、中、低3个药物治疗浓度，相当于生药量分别 为 143．00g／kg、71．50g／kg、35．75g／kg［1］；造 模 药MPTP采用生理盐水配制成浓度为0．33%的溶液；美多巴阳性对照药采用CMC溶解配制成浓度为12．5mg／mL的溶液。

1．2 方法

1．2．1 PD小鼠模型建立 造模采用 MPTP（30mg·kg－1·d－1）诱导模型，腹腔注射，每日1次，连续5d［2］。造模前1d，筛选能连续游泳1min的健康小鼠做为实验对象，以消除小鼠的运动能力差异。

1．2．2 动物分组与给药 为达到药物有效浓度，中药治疗各组小鼠从首次注射MPTP前3d开始分别给予不同浓度的YZXFD灌胃给药（10mL／kg）；阳性对照组小鼠给予美多巴（10mL／kg）灌胃；空白和模型对照组给予生理盐水灌胃（10 mL／kg），持续28d。

1．2．3 行为学检测 游泳实验：自制20cm×30cm×20cm规格的水箱，控制水温28～30℃。放入受试小鼠，观察并记录小鼠1min内游泳状态。能够连续不断游泳的小鼠计3．0分；大部分时间游泳仅偶尔漂浮者计2．5分；漂浮时间超过30s的计2．0分；偶尔游泳的计1．5分；漂浮在一边仅偶尔用后肢游动的计1．0分［2］。

1．2．4 组织形态学观察 实验第14、28天随机选取各组小鼠处死制成切片，常规4．0%多聚甲醛透心灌注固定，根据小鼠大脑图谱黑质位置做冠状石蜡切片，片厚5um。采用尼氏体染色（0．2%的硫堇溶液浸洗30min）观察多巴胺神经元组织形态和数量的改变。

1．2．5 nNOS、iNOS染色 采用SABC免疫组织化学法染色：常规3%H2O2灭活内源性酶；枸橼酸盐微波煮沸修复；一抗分别用1∶150兔抗小鼠nNOS、iNOS。阴性对照以PBS代替一抗进行染色。

1．3 统计学处理 采用SPSS 13．0统计软件对数据进行分析处理，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 行为学检测 注射MPTP 5～10min后，小鼠即出现肢体震颤、竖毛、竖尾及跳窜等典型动作，持续20～30min后，小鼠活动明显减少，动作迟缓，甚至匍匐不动，符合PD小鼠模型行为学表现［1］。游泳试验结果显示，模型对照组小鼠游泳时间较空白对照组游泳时间缩短，且随着用药时间的延长而逐渐降低，尤其从第3天开始差异有统计学意义（P＜0．05），显示PD造模成功。中药治疗组与模型对照组比较，小鼠游泳能力有所改善，评分增加，尤其以YZXFD高剂量治疗组改善明显，差异有统计学意义（P＜0．05）［3］。

2．2 YZXFD对各组小鼠中脑黑质DA神经元数目的影响结果显示，空白对照组小鼠黑质致密部DA神经元内尼氏体分布均匀，神经元胞体饱满整齐，呈带状分布，数量密集；模型对照组神经元带状分布松散，残存神经元形态各异［4］，与空白对照组比较，神经元数量明显降低（P＜0．01），见表1；中药治疗组神经元数量较模型对照组增多，神经元胞体较饱满，结构较清晰。2．3 YZXFD对各组小鼠中脑黑质nNOS、iNOS的影响

表1 YZXFD对PD模型小鼠SN中尼氏体染色DA神经元细胞数目的影响（x±s，n＝15）

表2 YZXFD对PD模型小鼠SN中nNOS、iNOS蛋白表达的影响（x±s，n＝15）

图1 实验第14天黑质内nNOS免疫组织化学法蛋白表达（SABC法，×400，scale bar＝5μm）

图2 实验第14天黑质内iNOS免疫组织化学法蛋白表达（SABC法，×400，scale bar＝5μm）

nNOS、iNOS免疫反应阳性细胞，均表现为较为粗大的棕黄色颗粒，主要为胞质表达。与空白对照组比较，模型对照组nNOS和iNOS蛋白含量都显著增多（P＜0．05），见图1、2。中药治疗组及阳性对照组较模型对照组nNOS和iNOS蛋白含量减少，尤其以YZXFD高剂量组减少明显，差异有统计学意义（P＜0．01），分别减少38．6%（第14天）和38．0%（第28天），见表2。

3 讨 论

现代中医学对熟地、龟板、鹿角胶的药理作用做了相关研究，发现其均有增强大脑学习记忆，抗衰老、抗氧化、抗突变作用［5－7］。苗明三等［8］研究发现熟地黄中的多糖有较好的抗衰老作用，能提高小鼠衰老模型脑中酶类自由基清除剂的活力，降低脑匀浆过氧化脂质（LPO）水平。提示熟地可通过提高血中抗氧化相关酶的活性，起到一定的抗氧化作用。育真熄风汤以熟地、龟板、鹿角胶为君药，包含18种滋补肝阴肾气、益气补脾的有效中药成分，从多靶点、多途径整体调节机体功能，化疾通络，熄风止痉，符合中医治疗颤症的理论。

作者采用游泳法和尼氏体病理染色的方法，从行为学和组织形态学两方面观察小鼠的协调运动能力和DA神经元的改变。结果显示，模型对照组与空白对照组小鼠运动能力存在统计学差异，提示PD模型建立的成功和可靠。随着用药时间的延长，YZXFD治疗组小鼠的运动协调能力及DA神经元的数量都有不同程度的改善和提高，尤其以YZXFD高剂量组效果明显。说明YZXFD对PD小鼠的行为学障碍有显著改善作用和对多巴胺神经元的保护作用。

NO作为自由基家族的成员，近年研究表明，过多地在中枢神经系统内生成能引发神经细胞损伤，导致帕金森病及其他神经退行性疾病［9－11］。NOS是NO合成最关键的限速酶，有3种亚型，其中，nNOS属结构型NOS，正常情况下在神经元中仅有低水平表达。Vincent等［12］研究发现，大鼠局部脑缺血时同侧的nNOS、mRNA明显增加，而nNOS基因敲除的小鼠能明显抵抗脑缺血性损伤［13］，提示来源于nNOS的NO参与对神经的毒性作用。iNOS在正常健康人的脑中不表达或表达很少，但病理情况下，如炎症细胞因子免疫应答、神经损伤等情况下表达增多，且产生比nNOS更多且持续更长时间［14］。因此，来源于iNOS和nNOS的NO都具有神经毒性作用，可作为重要的介导因素被激活，从而引起神经元的毒性作用，导致神经元的凋亡或细胞坏死［15］。作者在实验中也得出 MPTP模型小鼠SN内在第14、28天的nNOS和iNOS有明显升高。而经过YZXFD中药预防和治疗后的小鼠与模型组比较，其行为学障碍有明显改善，DA神经元数量增加，nNOS和iNOS有明显降低。因此，作者有理由认为YZXFD可以通过抑制nNOS和iNOS的活性，进而降低其对DA神经元的毒性作用，发挥保护DA神经元、抗帕金森病的作用。

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