低盐胁迫下条斑紫菜不同品系体细胞与壳孢子的耐受性差异

吕峰+周爽

摘要：以条斑紫菜野生品系WT为对照，对条斑紫菜选育品系NY-001的体细胞与壳孢子阶段的耐低盐特性进行测定，结果表明：在正常盐度（2.6%）下培养14 d，WT、NY-001品系条斑紫菜的体细胞苗与壳孢子萌发体的存活率与分裂率均无显著差异；在1.5%下培养14 d，WT品系条斑紫菜体细胞的存活率、分裂率分别为62.8%、98.8%，而NY-001品系的存活率、分裂率则分别为77.4%、100.0%，WT品系的壳孢子存活率、分裂率分别为63.9%、96.8%，而NY-001品系的存活率、分裂率则分别为88.0%、100.0%；在0.8%盐度条件下培养14 d的WT条斑紫菜品系体细胞存活率分别为38.5%、88.6%，而NY-001品系的存活率、分裂率则分别为52.3%、99.6%，WT品系的壳孢子存活率、分裂率分别为445%、71.4%，而NY-001品系的存活率、分裂率则分别为76.2%、96.7%；在0.3%盐度条件下培养14 d的WT品系条斑紫菜的体细胞存活率、分裂率分别为30.2%、74.2%，而NY-001品系的存活率、分裂率则为33.3%、98.7%，WT品系的壳孢子存活率、分裂率分别为5.2%、28.8%，而NY-001品系的存活率、分裂率则分别为29.6%、85.2%。由结果分析可知：与野生品系相比，NY-001品系条斑紫菜具有较好的耐低盐潜力，可以在此基础上进一步选育，以选拔出适合低盐海区养殖的条斑紫菜新品种，为养殖生产服务。

关键词：低盐胁迫；条斑紫菜；壳孢子；耐受性；体细胞；盐度；存活率；分裂率

中图分类号： Q945.78文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0221-04

收稿日期：2014-04-23

基金项目：江苏省南通市科技创新计划（农业）（编号：AL2010003）。

作者简介：吕峰（1979—），男，江苏南通人，博士研究生，讲师，主要从事海洋经济动植物遗传育种研究。E-mail：prlf2019@163.com。潮间带是一个条件变化频率特别高的环境，生活在潮间带的海藻，每天都要经受着露出、淹没的陆、水2种环境的变化：落潮时暴露在大气中经受干旱失水或雨水浸洗，使盐度迅速增加或降低；潮水上涨后又回到正常的海水中正常生活，因此能够耐受较为广泛的盐度[1]。条斑紫菜（Porphyra yezoensis）是生活在潮间带的一种广盐性海藻，在2.6%～3.3% 的盐度范围内都能正常生长，适合在不同盐度的海域栽培[2]；但当栽培海域盐度降至2.6%以下时，由于条斑紫菜野生品系经过几十年的重复使用而未经选育，其表现较为敏感。近些年来，在紫菜海区栽培期间，经常遭遇强台风及河流上游持续性的强降雨，导致表层海水的盐度急剧下降，造成一定量的孢子苗脱网和幼苗死亡，对产量的影响较大[3]，加上目前条斑紫菜野生栽培种已经无法适应河口等低盐度海区，亟待育种改良。此外，我国海岸的一个主要特点是河口众多、淤泥质海岸分布广泛[2]，十分适合紫菜的栽培。因此，条斑紫菜耐低盐优良品系的选育既能保证大规模栽培的顺利进行，又有利于其向低盐度入海河口区扩展，从而缓解传统栽培海区的栽培压力；此外，对于像南通市洋口港等富营养化严重的低盐度海湾地区的生态修复也能起到积极作用。本研究结合 60Co-γ 射线人工诱变、低盐胁迫和细胞工程育种等方法筛选到1个条斑紫菜耐低盐突变体NY-001，在其生活史的不同阶段，叶状体细胞和F1代壳孢子均表现出一定的耐低盐性，可以作为耐低盐品系继续选育并应用于生产。

1材料与方法

1.1试验材料

本试验所用条斑紫菜野生品系（WT）由江苏省如东县海区半浮动筏上自然生长的叶状体中分离出来，并以自由丝状体的形式保存于笔者所在实验室内，保存条件参照相关文献[4]。条斑紫菜突变体NY-001是以WT叶状体为材料，经 60Co-γ 射线人工诱变[5]和低盐胁迫后筛选获得的，其丝状体纯系分离和保存方法同WT。

1.2条斑紫菜贝壳丝状体及叶状体的室内培养方法

1.2.1贝壳丝状体的室内培养方法取适量的自由丝状体，加入少量灭菌海水后倒入小型打碎机中，将其打碎后均匀地洒在事先高温灭菌的文蛤壳表面，使其植入壳内。培养条件：盐度2.6%，温度（18±1） ℃，光照度20～30 μmol/（m2·s），光-暗周期10 h-14 h，培养液由灭菌海水和MES培养基配制而成。培养14 d后第1次清洗贝壳，将其表面多余的自由丝状体除去，加入新鲜培养液，以后每隔7 d清洗1次。培养数周后，待贝壳表面长满丝状体时，将培养温度提高至 （22±1） ℃，光照度降至10～20 μmol/（m2·s），光-暗周期调整为8 h-16 h，培养液盐度不变。约4周后，贝壳表面就会形成1层膨大藻丝。

1.2.2叶状体的室内培养方法取1～2个上述长满膨大藻丝的贝壳置于500 mL烧杯中，加入约100 mL培养液和4～6根灭菌棉线（供壳孢子附着），在正常盐度下（2.6%）充气培养（促进壳孢子的放散），培养条件为：温度（18±1） ℃，光照度50～60 μmol/（m2·s），光-暗周期10 h-14 h。每天12：00（壳孢子一般在10：00开始放散）取出棉线镜检，当棉线上附有壳孢子时，将其置于500 mL充气瓶中充气培养。当叶状体长至约1 cm时，将它们从棉线上摘下，继续充气培养，1周换1次培养液，培养条件：温度（18±1） ℃，光照度50～60 μmol/（m2·s），光-暗周期10 h-14 h。

1.3WT和NY-001体细胞对低盐胁迫的耐受性检验

将日龄为40 d的WT和NY-001的叶状体用海螺酶酶解分离出体细胞，方法同相关文献[6]。将各品系分离得到的单个体细胞分别置于小号培养皿（直径=6 cm）内，培养液盐度为4.0%，静止72 h后，记录每个培养皿内的体细胞数（30个视野，10×），获得单个视野的体细胞平均数，然后在盛有细胞的培养皿中分别换入0.3%、0.8%、1.5%、2.6%4种不同盐度的培养液进行培养，并将盛有细胞的小号培养皿放入中号培养皿（直径=9 cm）中，再将两者一起放入已盛有一定蒸馏水的大号培养皿（直径=12 cm）中，以减少因培养液水分蒸发而引起的盐度增大[3]，光照度为40 μmol/（m2·s），其他培养条件同“1.2”节。每隔3 d换1次培养液，并观察1次体细胞的存活、分裂情况。endprint

1.4WT和NY-001壳孢子对低盐胁迫的耐受性检验

将各品系刚放散的壳孢子分别倒入4个小号培养皿（直径=6 cm）中，在正常盐度（2.6%）下静止培养24 h后统计每个培养皿中单个视野的平均壳孢子数（30个视野，10×）[7]，然后在附有壳孢子的培养皿中分别换入0.3%、0.8%、15%、2.6% 盐度的培养液进行培养，不同盐度的培养液由海水、蒸馏水、MES培养基配制而成[3]，然后将盛有壳孢子的小号培养皿放入中号培养皿（直径=9 cm）中，再将两者一起放入已盛有一定蒸馏水的大号培养皿（直径=12 cm）中，以减少因培养液水分蒸发而引起的盐度增大[3]，培养条件：温度24 ℃，光照度50 μmol/（m2·s），光-暗周期10 h-14 h，每隔3 d换1次培养液，并观察壳孢子的存活、分裂情况。

2结果与分析

2.1WT与NY-001体细胞对低盐胁迫的耐受性比较

由表1可见，在正常盐度（2.6%）下培养14 d，野生品系和耐低盐品系NY-001的体细胞苗存活率无显著差异，培养14 d的存活率分别为80.5%、81.2%。由表2可见，在正常盐度（2.6%）下培养5 d，各品系分裂率均能在60%左右；培养11 d，分裂率已接近100%；培养14 d，2个品系的分裂率均可以达到100%，且无显著性差异。由表1还可以看出，在15%盐度条件下培养5 d，各品系体细胞存活率均为90%左右，且差异不显著；而培养11 d后，WT体细胞存活率下降明显，只有68.4%；培养14 d后，WT存活率只有62.8%，而耐低盐品系NY-001的存活率则为77.4%，两者相比差异显著（P<0.05）。由表2 可见，1.5%盐度条件下，分裂率随着培养时间的延长而逐渐上升，到培养14 d，WT的分裂率为988%，耐低盐品系NY-001的分裂率达到100.0%，但二者之间无显著性差异。

系，培养14 d后存活率仅为 38.5%，而NY-001品系为523%，为WT品系的1.36倍，且差异极显著（P<0.01）；随着时间的增加，分裂率逐渐提高，到培养14 d时，NY-001品系的分裂率就已达99.6%，而WT品系只有88.6%。在0.3% 下培养8 d，WT体细胞的存活率明显下降，只有476%，分裂率也仅有34.0%；随着培养时间的延长，到培养14 d时，0.3%低盐度组中WT品系体细胞的存活率继续下降至30.2%，分裂率也受到一定影响，最终仅为74.2；在 0.3% 下培养14 d，耐低盐品系NY-001的存活率逐渐下降至333%，与WT品系相比无极显著差异。总体看出，没有任何一个品系体细胞全部分裂，说明0.3%不利于条斑紫菜生长。

如图1-A至图1-D所示，WT品系条斑紫菜在1.5%下培养2周，体细胞萌发体生长情况最接近于正常盐度组（2.6%）；而在0.8%组，WT体细胞萌发体部分细胞的色素体溢出（如箭头所示），部分细胞色素体转淡，假根处细胞开始膨大，假根发育不正常；在0.3%组，存活的体细胞苗分裂速度明显变慢，部分细胞死亡和色素体溢出而导致其细胞数目极少。与此相比，由图1-E至图1-H可见，各盐度组下培养的NY-001品系条斑紫菜的体细胞萌发体的形态和生长情况较野生品系更良好：在0.8%下培养2周，NY-001品系的体细胞萌发体细胞排列整齐，无色素体溢出；在0.3%下培养2周，NY-001 品系体细胞萌发体也无法形成正常的假根，但萌发体中死亡细胞的比例较野生型小，尚能较好地维持细胞活性。

2.2WT和NY-001壳孢子对低盐胁迫的耐受性比较

表5至表8为WT与NY-001品系条斑紫菜在0.3%、0.8%、1.5%、2.6%下培养14 d的壳孢子存活率、分裂率。由表5可见，在正常盐度（2.6%）下，随着培养时间的延长，各品系条斑紫菜壳孢子的存活率逐渐下降：培养5 d，各品系壳孢子的存活率基本维持在90%以上，耐低盐品系NY-001的存活率与野生型相比，无显著差异；培养14 d，各品系壳孢子的存活率基本达到稳定状态，WT品系的存活率只有804%，与NY-001有显著性差异（P<0.05）。由表6可见，各品系壳孢子的分裂率随着培养时间的延长而逐渐上升，培养14 d，2.6%盐度处理下，2个品系壳孢子的分裂率均为100.0%，不存在显著性差异。

如表5所示，与2.6%处理一样，1.5%处理各品系壳孢子的存活率也随着培养时间的延长而逐渐下降：培养8 d后，WT品系壳孢子的存活率只有71.0%，与NY-001品系的94.2%存在极显著差异（P<0.01）；培养14 d后，WT品系壳孢子的存活率下降为63.9%，而选育品系的存活率高达880%，与NY-001品系有极显著差异（P<0.01）。由表6可见，1.5%处理的分裂率与2.6%处理相比也略有下降：培养8 d后，选育品系的分裂率在90%以上，而野生品系的分裂率只有70.3%，与WT品系存在显著差异（P<0.05）；培养 14 d，选育品系的分裂率达100.0%，WT品系的分裂率为968%，与WT品系无显著差异。由表7可知，与1.5%、2.6% 组相比，0.8%盐胁迫处理2个品系壳孢子的存活率随着培养时间的延长而明显下降：培养8 d后，WT品系壳孢子的存活率下降至57.3%，与NY-001品系的86.9%存在极显著差异（P<001）；培养14 d，WT品系壳孢子的存活率不到50%（445%），NY-001品系壳孢子的存活率为762%，为WT品系的1.7倍，且差异极显著（P<0.01）。由表8可见，0.8%盐度下，2个品系壳孢子的分裂率与1.5%、2.6% 组相比也有明显下降，培养14 d后，WT 、NY-001品系壳孢子的分裂率分别为714%、96.7%，可见选育品系的分裂率与野生品系相比存在极显著差异（P<0.01）。与 2.6% 处理相比，0.3%处理各品系壳孢子的存活率随着培养时间的延长而急剧下降：培养8 d后，WT品系壳孢子的存活率不到20%（15.3%），与NY-001品系的51.4%存在极显著差异（P<001）；培养14 d，WT品系壳孢子的存活率非常低，只有52%，NY-001品系壳孢子的存活率也不高，为296%，为WT品系的5.7倍，差异极显著（P<0.01）。如表8所示，03%盐度下，各品系壳孢子的分裂率与 2.6% 组相比也表现为急剧下降，培养14 d后，各品系壳孢子的分裂率均未达到100%，分别为28.8%、85.2%。综合比较可见，选育品系的分裂率与野生品系相比存在极显著差异（P<0.01）。endprint

从图2可以看出，培养2周的WT品系在2.6%盐度处理下壳孢子萌发体颜色鲜艳，有光泽，形状规则，细胞排列均匀，星状色素体清晰（图2-A）；1.5%处理的壳孢子苗假根处细胞色素体收缩、部分细胞排列不均匀（图2-B）；0.8% 组的壳孢子苗颜色加深，光泽变差，形状变畸形，大部分细胞变小且色素体明显收缩、假根处细胞部分死亡（图2-C）；0.3%组的壳孢子苗颜色更深，无光泽，无假根，基部细胞全部死亡，只剩少量稍部细胞，苗体畸形（图2-D）。与此相比，培养2周后，各盐度组NY-001品系的壳孢子萌发体生长明显优于WT品系，只是0.3%处理的壳孢子萌发体颜色略有加深，个别细胞色素体收缩，出现假根腐烂的情况（图2-E至图2-H）。

3结论

紫菜是一种广盐性海藻，在2.6%～3.3%的盐度范围内都能正常生长，适合在不同盐度的海域栽培[2]；但当栽培海域盐度降至2.6%以下时，由于条斑紫菜野生品系经过几十年的重复使用而未经选育，其表现较为敏感，尤其是壳孢子的存活率、分裂率均会发生显著的变化，这在本研究的试验结果中得到印证。

目前紫菜的人工大规模栽培所选用的栽培种仍为野生种，经几十年的反复使用，未经选育，由于栽培过程中种质来源单一、优良性状的分离以及遗传结构的不稳定，进而导致抵抗低盐、高温、病害等逆境的耐受性大大降低[8-9]，使得紫菜的产量和质量得不到保障；因此筛选优质、高产、抗逆性强的新品系有利于促进紫菜栽培业的持续健康发展。

严兴洪等研究发现，当盐度低于1.96%时，条斑紫菜叶状体的营养细胞存活率显著降低[10]；严兴洪等的其他研究也发现，坛紫菜野生品系的体细胞在0.8%下培养6 d后开始吸水膨胀，细胞内色素体以外的空隙明显增大[3]。本研究表明，在0.8%下，NY-001品系的体细胞及壳孢子的存活率与分裂率也均显著降低，但在同等条件下，都比WT品系耐低盐胁迫能力增强；当盐度下降至0.3%时，虽然NY-001品系的体细胞及壳孢子的存活率、分裂率仍然明显高于WT品系，但观察其细胞形态和结构，已出现了部分细胞的溃败与凋亡。

条斑紫菜的生活史分为单倍体的叶状体阶段与二倍体的丝状体阶段[7]，而体细胞属于叶状体阶段细胞，壳孢子则属于丝状体发育成熟后产生的F1代细胞，为了验证中选育出的NY-001品系的耐低盐性能否稳定遗传到后代中，笔者对该品系生活史的2个阶段的细胞做了详细的低盐胁迫条件下的测试，试验结果初步证实，在体细胞阶段和壳孢子阶段，NY-001品系的耐低盐特性都是显著优于WT品系的。

综上所述，筛选得到的优良品系NY-001的耐低盐性是显著优于WT品系的，可以对其进行进一步选育，并逐渐把它们培育成耐低盐的优良品种，用于海区养殖生产，为地方特色产业发展提供品种保障。

参考文献：

[1]赵素达，董树刚，吴以平，等. 盐胁迫对孔石莼的生理生化影响[J]. 海洋科学，2000，24（7）：52-55.

[2]陈昌生，纪德华，谢潮添，等. 坛紫菜耐低盐品系的选育及经济性状的比较[J]. 集美大学学报：自然科学版，2009，14（1）：1-7.

[3]严兴洪，陈敏. 坛紫菜耐低盐优良品系的筛选[J]. 上海水产大学学报，2008，17（3）：316-320.

[4]Kato M，Aruga Y. Comparative studies on the growth and photosynthesis of the pigmentation mutants of Porphyra yezoensis in laboratory culture[J]. Jap J Phycol，1984，32：333-347.

[5]严兴洪，梁志强，宋武林，等. 坛紫菜人工色素突变体的诱变与分离[J]. 水产学报，2005，29（2）：166-172.

[6]Yan X H，Wang S J. Studies on the development and differentiation of somatic cells in Porphyra spp. （Rhodophyta）[J]. Marine Sciences，1990，3（2）：195-208.

[7]王华芝，严兴洪，李琳. 条斑紫菜（Porphyra yezoensis）耐高温品系的筛选及特性分析[J]. 海洋与湖沼，2012，43（2）：363-369.

[8]严兴洪，黄林彬，周晓，等. 坛紫菜叶状体的细菌性红烂病研究[J]. 中国水产科学，2008，15（2）：313-322.

[9]王长青，严兴洪，黄林彬，等. 坛紫菜优良品系“申福2号”的特性分析与海区中试[J]. 水产学报，2011，35（11）：1658-1667.

[10]严兴洪，江海波. 盐度对条斑紫菜体细胞生长发育的影响及耐低盐应变异体的初步观察[J]. 上海水产大学学报，1993，2（1）：34-40.张燕萍，王海华，吴斌，等. 沙塘鳢属鱼类种质资源研究和保护进展[J]. 江苏农业科学，2015，43（2）：230-232.endprint