木霉菌分离培养基的优化及对黄萎病的拮抗筛选

刘政　孙艳　张学坤　陈兵

摘要：为了确定适合从土壤中分离木霉菌的培养基，设计5种不同的组合配方，经研究发现，土壤稀释10倍后用改良的PDA+0.15 g/L孟加拉红培养基分离土壤，能够减少菌落重叠，使菌落容易辨别，适合木霉菌的分离；经过平板对峙培养，筛选出4株对棉花黄萎病具有拮抗作用的木霉菌，分别为T1、T10、T25、T34，其生长速率分别是棉花黄萎病菌的7.89、7.92、7.87、7.76倍。

关键词：木霉菌；培养基；黄萎病菌；拮抗筛选

中图分类号：S435.621.2 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0121-03

收稿日期：2014-03-17

基金项目：国家自然科学基金（编号：31360452、41161068）；兵团技术转移项目（编号：2012BD057）；兵团青年创新基金（编号：2011CB001）。

作者简介：刘政（1979—），男，安徽阜阳人，硕士，助理研究员，主要从事棉花病害生物防治方面的研究。Tel：（0993）6683537；E-mail：lzh8200@126.com。土壤是微生物生存的大本营，木霉菌是土壤中普遍存在的一类真菌，属于半知菌类丝孢目丛梗孢科木霉属（Trichoderma spp.）[1]。它可以产生一些抗生物质并寄生在其他真菌上[2-3]，与其他微生物形成空间或营养上的竞争关系[4-6]，能够抑制或降解某些病原物为侵入植物而分泌的果胶酶和其他酶类的合成[7]；此外，还与植物建立协同共生的关系，并能诱导植物抗性、激发植物防御反应机制等[8]。目前，木霉菌作为生物防治的优势菌在植病生防中的应用潜力越来越受到重视，而木霉菌在从土壤分离培养的过程中因土壤微生物种类较多、群落结构复杂，极易漏筛掉优良的木霉菌株，所以选择适合木霉菌分离的培养基非常关键。本研究设计5种不同配方的培养基和不同的稀释浓度，利用新疆兵团棉花黄萎病严重发病的土壤为研究材料，找到适合木霉菌分离的培养基和稀释浓度，筛选出拮抗性强的木霉菌并研究其对棉花黄萎病菌的拮抗作用，为今后从土壤中大批量地筛选木霉菌提供一套可行的方法，同时筛选获得的木霉菌株为今后开展小区试验和田间试验提供基础条件。

1材料与方法

1.1木霉菌分离培养基的配制

1.1.1木霉菌基础分离培养基（1）PDA培养基。马铃薯200 g、葡萄糖30.0 g、琼脂20.0 g，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min备用。（2） TSM培养基。K2HPO4 0.9 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、KCl 0.15 g、NH4NO3 1.0 g、葡萄糖3.0 g、孟加拉红0.15 g、60%敌克松可湿性粉剂0.3 g、五氯硝基苯（PCNB） 0.2 g、琼脂20.0 g，蒸馏水定容至1 000 mL ，121 ℃灭菌20 min，用之前加入100 mg/L氯霉素。

1.1.2木霉菌改良分离培养基设置TSM培养基、TSM培养基+0.08 g/L三唑酮、PDA+0.15 g/L孟加拉红、PDA+015 g/L孟加拉红+0.2 g/L PCNB、PDA+0.15 g/L孟加拉红+0.2 g/L PCNB+0.08 g/L三唑酮5种培养基。

1.2木霉菌分离培养基和稀释浓度的筛选

采集来自于不同地区的10份土样，用以上5种培养基分离木霉菌，设置3个稀释浓度梯度，分别为10-1、10-2、10-3，根据分离筛选结果，选出最佳分离培养基和稀释浓度。

稀释平板法：称取土样10 g，放入装有90 mL灭菌蒸馏水及小玻璃珠的250 mL三角瓶中，在摇床上以120 r/min摇 10 min，使土样充分分散，即成10-1倍稀释液；再吸取搅拌中的10-1倍稀释液1 mL移入装有9 mL灭菌蒸馏水的试管中，即成10-2倍稀释液；依此制成10-3倍稀释液（注意：每次一定要更换试管，连续稀释）。将融化的选择性培养基倒入培养皿中，每皿倒入15 mL。待培养基冷却成平板后，用无菌吸管按无菌操作过程分别吸取土样的10-3稀释液0.1 mL，于分离时用在培养基平板上，再用无菌刮铲将稀释液涂匀后培养，每个稀释浓度重复3次，置于培养箱中25 ℃恒温培养，待72 h后观察菌落，选定特征菌落，挑菌丝于新培养平板上培养。

1.3木霉菌株拮抗作用的初步研究

1.3.1平板对峙拮抗试验[9]将待测木霉菌与棉花黄萎病菌同步活化后，棉花黄萎病菌提前7 d接种于PDA平板上对峙培养，然后在黄萎病菌落对面接种木霉菌，平板直径为 90 mm，两菌间接种距离为50 mm，3 d后观察营养竞争情况，随后每天观察有无重寄生现象或抑菌现象，并记录拮抗情况。

1.3.2拮抗优势菌株与棉花黄萎病的生长速率观察将培养好的黄萎病菌和木霉菌打成直径均为5 mm的菌饼，分别接入直径为70、200 mm的PDA培养皿中心，置于27 ℃培养箱中生长，每天测量菌落直径，连续观察5 d后结束，比较木霉菌和黄萎病菌的生长速率。

2结果与分析

2.1木霉菌分离培养基和稀释倍数的筛选

培养基中PCNB对丝核菌及部分放线菌有抑制效果；孟加拉红对细菌有广谱抑制作用；适量的三唑酮能刺激孢子萌发，增加分生孢子产量，有效抑制轮枝菌生长；TSM培养基本身含有氯霉素、孟加拉红、敌克松、PCNB等多种抑菌成分。

由表1可知，稀释浓度为10-1 的PDA+0.15 g/L孟加拉红培养基中分离出的微生物数量较多，个别为细菌，绝大多数为木霉菌等真菌，易鉴别，有利于挑取菌丝、单孢分离等操作。而其他配方培养基和稀释浓度的分离效果均不理想，因此，选择稀释浓度为10-1 的PDA+0.15 g/L孟加拉红培养基来进行本试验中木霉菌分离培养，经过分离得到了38株木霉菌菌株。表1细菌培养基的筛选结果

培养基配方稀释浓度菌落生长情况TSM培养基10-1分离出的微生物数量很多，菌落重叠严重，大部分为细菌，少量为木霉等真菌10-2分离出的微生物数量较多，菌落重叠严重，大部分为细菌，个别为木霉等真菌10-3分离出的微生物数量较少，多数为细菌，木霉菌等真菌数量少TSM培养基+0.08 g/L三唑酮10-1分离出的微生物数量很多，菌落重叠严重，大部分为细菌，少量为木霉等真菌10-2分离出的微生物数量较少，多数为细菌，木霉菌等真菌数量少10-3分离出的微生物数量极少，多数为细菌，个别为木霉菌等真菌PDA+0.15 g/L孟加拉红10-1分离出的微生物数量较多，个别为细菌，绝大多数为木霉菌等真菌，有易于鉴别，利于挑取菌丝、单孢分离等操作10-2分离出的微生物数量极少，大量木霉菌等被抑制，无法分离出来10-3只分离出个别真菌微生物，木霉菌等几乎全部被抑制，无法分离出来PDA+0.15 g/L孟加拉红+0.2 g/L10-1分离出的微生物数量较多，菌落重叠严重，大部分为细菌，少部分为木霉等真菌PCNB10-2只分离出个别微生物，大量微生物无法分离出来10-3几乎无法分离出微生物PDA+0.15 g/L孟加拉红+0.2 g/L 10-1分离出的微生物数量很多，菌落重叠严重，大部分为细菌，个别为木霉等真菌PCNB+0.08 g/L三唑酮10-2分离出的微生物数量较多，菌落重叠严重，大部分为细菌，少量为木霉等真菌10-3分离出的微生物数量较少，多数为细菌，木霉菌等真菌数量少，无法分离出来

2.2木霉菌株拮抗作用的初步研究

木霉菌对棉花黄萎病菌的拮抗作用主要有营养竞争、重寄生作用、抗生作用。经过对峙拮抗筛选发现，木霉菌株T1、T10、T25、T34具有明显的营养竞争和重寄生作用，具体结果如图1所示。由图1可知，提前7 d接种棉花黄萎病菌，可让黄萎病菌落生长至一定的菌落大小，然后在其对侧接种木霉菌，结果发现4种木霉菌生长速度很快，能快速占据生存空间和争夺养分，而棉花黄萎病菌生长速度较慢，且受到明显的抑制，因为木霉菌的拮抗作用除了空间竞争作用外，还有重寄生作用和溶菌作用。

2.3拮抗优势菌株与棉花黄萎病的生长速率观察

由图2可知，将木霉菌T1与棉花黄萎病菌H5-1同时接入PDA培养基后，木霉菌生长迅速，初期菌丝为白色，3 d后出现同心轮纹状现象，5 d后几乎布满整个培养皿，其菌落直径是棉花黄萎病菌的7.89倍。

将筛选出来的木霉菌T10、T25、T34生长速率与棉花黄萎病菌H5-1进行比较，也表现出木霉菌生长速率很快而黄萎病菌生长速率缓慢的现象，到培养后5 d时，各菌株的生长速率分别是棉花黄萎病菌的7.92、7.87、7.76倍。

3小结

土壤中微生物种类多，如果不选择合适的培养基则很难从土壤中分离出各种木霉。因此，分别以TSM培养基和PDA培养基为基础培养基，设计5种不同配方的木霉菌培养基，来筛选分离木霉菌的最适培养基和最佳稀释浓度。TSM培养基本身含有氯霉素、孟加拉红、敌克松、PCNB等多种抑菌成分，具有较强的抑菌效果，对木霉菌也产生了一定的抑制作用，分离效果不佳；选用的孟加拉红+PDA 培养基减少了菌落重叠，使菌落容易辨别，根据稀释浓度来看，发现稀释10倍有利于木霉菌株的分离，因此最后确定土壤稀释10倍后用改良的PDA+0.15 g/L孟加拉红培养基能达到最佳分离效果，将得到的木霉菌株进一步进行拮抗试验，从而得到4株分离纯化的木霉菌。

在本试验中，木霉菌对营养和空间具有强烈的竞争能力，对病原菌的拮抗作用表现为生长迅速并覆盖黄萎病菌，缠绕在菌丝体上，使黄萎病菌菌落塌陷、解体分离等现象，说明4种木霉菌对棉花黄萎病菌都有一定程度的拮抗作用；进一步考察其生长速率，发现木霉菌菌落生长繁殖扩散很快，5 d后的生长速率是黄萎病菌的7～8倍，这可能是因为木霉菌在短期内大量繁殖，吸收大量的营养，通过营养竞争来拮抗黄萎病菌，从而达到防控棉花黄萎病的效果。不过土壤中微生物群落复杂，土壤中pH值、腐植酸和其他各种因子对木霉菌影响很大，单纯的平板对峙培养结果并不能完全反映木霉菌对棉花黄萎病的实际防治效果，因此获得的拮抗木霉菌株在田间的防治效果还有待进一步研究。

参考文献：

[1]汪天虹. 微生物分子育种原理与技术[M]. 北京：化学工业出版社，2005：288.

[2]高克祥，王淑红，刘晓光，等. 木霉菌株T88对7种病原真菌的拮抗作用[J]. 河北林果研究，1999，14（2）：159-162.

[3]郭江洪，文成敬. 木霉和绿粘帚霉对柑桔青霉病菌的拮抗作用[J]. 西南农业学报，2001，14（3）：59-62.

[4]Zimand G，Elad Y，Chet I. Effect of Trichoderma harzianum on Botrytis cinerea athogenicity[J]. Phytopathology，1996，86：1255-1260.

[5]纪明山，李博强，陈捷，等. 绿色木霉TR-8菌株对尖镰孢的拮抗机制[J]. 中国生物防治，2005，21（2）：104-108.

[6]史凤玉，朱英波，杨文兰. 长枝木霉T8对水稻纹枯病菌拮抗的作用研究[J]. 中国农学通报，2005，21（2）：264-265，271.

[7]Howell C R. Cotton seedling preemergence damping-off incited by Rhizopus oryzae and Pythium spp. and its biological control with Trichoderma spp.[J]. Phytopathology，2002，92（2）：177-180.

[8]Elad Y. Mechanisms involved in the biological control of Botrytis cinerea incited diseases[J]. Eur J Plant Pathol 1996，102：719-732.

[9]朱虹，汪章勋，樊美珍，等. 草莓灰霉病拮抗木霉菌株筛选及温室防效测定[J]. 中国生物防治，2005，21（1）：52-54.

潘晓曦，关一鸣，张舒娜，等. 中药提取物对人参灰霉病的防治效果[J]. 江苏农业科学，2015，43（2）：124-126.