芒萁叶斑病病原菌分离鉴定和生物学特性

谢美华等

摘要：对芒萁叶斑病进行病原鉴定，研究病原菌生物学特性和杀菌剂对其抑制作用。结果表明，该病原菌为拟盘多毛孢属真菌，最适宜生长的碳源为乳糖、氮源为硝酸钠。菌丝适宜生长的温度范围较窄，只能在15～30 ℃范围内生长，28 ℃ 菌丝生长最好，分生孢子在32 ℃时萌发率最高；适宜菌丝和分生孢子生长和萌发的pH值范围均较广，适宜菌丝生长的pH值为4.0，适宜分生孢子萌发的pH值为6.0；光周期对菌落生长的影响不大，光照有利于分子孢子的萌发。供试杀菌剂中以百菌清抑菌效果最好。

关键词：芒萁；叶斑病；病原鉴定；生物学特性

中图分类号： S435.67文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0130-04

收稿日期：2014-02-25

基金项目：云南省应用基础计划（编号：2011FZ186）；云南省高校科技创新团队支持计划；楚雄师范学院科研基金（编号：10YJYB02）；楚雄师范学院大学生创新创业训练计划（编号：2013cxcy04）。

作者简介：谢美华（1981—），女，云南楚雄人，硕士，实验师，从事植物病理学真菌病害研究。E-mail：xiemeihua@cxtc.edu.cn。

通信作者：杨海艳，博士，高级实验师，从事植物病理学真菌病害研究。Tel：（0878）3100784；E-mail：haiyanyang@cxtc.edu.cn。芒萁[Dicranopteris dichotomya （Thunb. ） Bernh.]是多年生常绿蕨类植物，广泛分布于中国长江以南各省区、朝鲜南部及日本，是酸性土壤指示植物，有药用价值[1]。在自然状态下，芒萁的种间竞争力极强，芒萁的化感物质释放到周围环境，抑制并排挤其他植物的生长发育，从而形成单优势的“纯植丛”群落[2]。近年来，关于芒萁的研究主要集中在生理生化指标的测定[3-4]、化感作用[5-9]、多糖和黄酮提取[9-11]等方面，但对芒萁叶斑病的研究目前还未见报道。本研究选取芒萁叶斑病病叶，对该病害进行分离鉴定和生物学特性研究，以期为芒萁叶斑病控制和防治方面提供理论基础。

1材料与方法

1.1病原菌的分离

自楚雄彝族自治州西山公园采集到9组芒萁叶斑病的病叶进行培养，共分离到3个菌株，其中，1株是交链孢属菌株，1株是黑曲霉属菌株，1株是拟盘多毛孢属菌株。将纯培养得到的3个菌株孢子悬浮液接种到健康的芒萁叶片上，每组设24个重复。10 d后，接种了交链孢属和黑曲霉属的植株依然健康，而接种了拟盘多毛孢属菌株的植株出现了叶斑病。从接种发病的芒萁植株上再分离到的纯培养，性状与接种物相同。从而推测其为芒萁叶斑病的病原，菌株编号为mangqi01。

1.2病原菌的鉴定

1.2.1形态学鉴定纯化分离到的病原菌，利用显微镜进行观察，对其进行形态鉴定。

1.2.2病原菌rDNA-ITS序列扩增和分析用CTAB法提取病原菌全基因组DNA，进行ITS-PCR扩增。引物序列为ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR反应体系总体积25 μL，反应各成分终浓度为：Taq酶0.02 U/μL；引物 0.4 μmol/L；DNA 模板20 ng/μL；dNTPs 0.4 μmol/L；2× PCR反应缓冲液。PCR扩增程序为：95 ℃预变性，3 min； 94 ℃变性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃复性45 s，30个循环；72 ℃ 延伸10 min。扩增产物送北京百泰克生物技术有限公司测序，所得序列在NCBI上比对，下载与其相似性较高的序列及其近似属的序列，用BioEdit、Clustal x和MEGA 4.1软件采用NJ法进行系统分析，构建系统进化树。

1.3生物学特性研究[12-13]

1.3.1不同碳源和氮源对菌落生长的影响以察氏培养基为基础培养基，分别以葡萄糖、甘油、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等量取代其碳源；分别以硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸、L-苯丙氨酸、牛肉膏、蛋白胨取代氮源。每种培养基中分别接种直径为5 mm的菌块，25 ℃恒温黑暗培养，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。每个处理设3个重复。

1.3.2不同温度对菌落和分子孢子萌发的影响取直径为5 mm的菌块接种于察氏培养基中央，分别在5、10、15、20、25、28、30、32、35、40、45 ℃黑暗下恒温培养，5 d后测量菌落直径。用无菌水制备菌悬液，滴于载玻片上，培养条件同菌落培养，24 h后镜检孢子萌发率，每次检100个孢子。每个处理设3个重复。

1.3.3不同pH值对菌落和分子孢子萌发的影响将高压灭菌后的察氏培养基pH值分别调为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、80、9.0、10.0、10.9倒平板，取直径5 mm的菌块接种于察氏培养基中央，黑暗条件下25 ℃培养5 d后测量菌落直径。用0.2 mol/L磷酸氢二钠和0.2 mol/L柠檬酸缓冲液将分生孢子悬浮液pH值调配为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、100、10.9，置于25 ℃恒温箱黑暗培养，24 h后镜检萌发率，每次检100个孢子。每个处理设3个重复。

1.3.4不同光照处理取直径为5 mm的菌块接种于察氏培养基中央，分别置于24 h光照、光-暗周期12 h-12 h、24 h 黑暗环境中，25 ℃培养5 d后测量菌落直径。用无菌水制备菌悬液，滴于载玻片上，培养条件同菌落培养，24 h后镜检孢子萌发率，每次镜检100个孢子。每个处理设3个重复。

1.4不同杀菌剂对菌落生长的影响

将代森锰锌、百菌清、敌克松、霜·锰锌和扑海因用无菌水按其常用倍数稀释，每10 mL培养基中加入1 mL药液制成含药液的平板，对照组加入等量无菌水。取5 mm菌块置于察氏培养基平板中央，25 ℃黑暗培养5 d后测量菌落直径。每个处理设3个重复。

2结果与分析

2.1芒萁病原菌的鉴定

2.1.1形态学鉴定该病主要发生在叶部，发病初期，叶缘、叶脉出现灰色、灰黑色小斑点；中期小斑点扩大成不规则灰色轮纹，其上着生黑色斑点，并伴有叶黄化、卷曲等症状，病情严重时整个叶片枯萎掉落。PDA培养基上，28 ℃培养3 d后菌落直径6 cm，隆起，菌丝白色、絮状，直径1.5 cm处有明显的轮纹，反面杏色，直径1.5 cm处出现深杏色轮纹，且轮纹上的培养基呈辐射形开裂；菌丝生长速度快，28 ℃培养5 d后菌落直径为5 cm；长满全皿，正面白色，不均匀分布黄褐色菌丝，反面出现深褐色不规则小圆点；培养10 d，正面不均匀分布透明水滴及黑色油滴，反面均匀分布深褐色圆点，不均匀分布黑点（图1）。分生孢子5细胞，多为竹节状或棒状，少数为纺锤形，直立或弯曲，向基部渐尖；中间3色胞异色型，第1、2色胞褐色，梯形，第2色胞外壁加厚，第3色胞浅褐色，半透明，分隔处缢缩或不缢缩；顶胞多为长梯形或圆柱形，少数为三角形，透明，具侧生式顶端附属丝1～3根，多为2根；基部细胞圆锥形或锥形，不具或只具中生式基部附属丝1根；大小（3.7～5.9）×（4.2～6.7） μm（平均3.95×6.3 μm）（图2、图3）。

2.1.2病原菌rDNA-ITS序列分析将mangqi01菌株的5.8S rDNA-ITS序列在NCBI里进行序列比对，结果显示mangqi01与Pestalotiopsis sp.、Pestalotiopsis oxyanthi、Pestalotiopsis foedans、Pestalotiopsis clavispora、Pestalotiopsis ixorae和Pestalotiopsis mangiferae同源性最高，下载它们的序列，以Pestalotia cinchonae和Pestalotia subcuticularis为外群，用BioEdit、Clustal x和MEGA 4.1软件采用NJ法进行系统分析，构建系统进化树，结果（图4）表明，与其遗传距离较近的有6个种，属内节点支持率为0.96，结合其形态特征的观察研究，供试菌株mangqi01为腔孢纲（Coelomycetes）黑盘孢目（Melanconiale）拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis Stey.）[14-16]，病原菌的种待定。

2.2不同氮源和碳源对mangqi01菌落生长的影响

试验结果表明，该菌对供试的7种氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培养基上生长速度有明显差异。最适该菌生长的氮源是硝酸钠，与硫酸铵、硝酸铵、L-苯丙氨酸、牛肉膏、甘氨酸和蛋白胨作氮源差异极显著。最适该菌生长的碳源是乳糖，与可溶性淀粉、蔗糖和葡萄糖差异不显著；与D-半乳糖、D-果糖和甘油差异极显著（表1）。

2.3不同光照对mangqi01菌株生长的影响

通过24 h光照、12 h光/暗交替、无光照培养，有无光照对菌落的生长影响差异不显著。光照条件下分生孢子萌发率最高，与12 h光/黑影响无显著差异，与黑暗条件培养达到极显著差异（表2）。

2.4不同温度对mangqi01菌落生长和孢子萌发的影响

试验结果表明，该病原菌生长适应的温度范围较窄，只能在15～30 ℃范围内生长 最适的生长温度是28 ℃，与25 ℃

2.5不同pH值对mangqi01菌落生长和孢子萌发的影响

试验结果表明，菌丝和分生孢子萌发适应的pH值范围较广，在pH值2.5～10.9之间均能生长和萌发。该菌菌丝在酸性条件下长得较好，pH值4时菌丝生长最快，与pH值9、 pH值10和pH值10.9差异极显著；与其他处理差异不显著。pH值6.0时孢子萌发率最高，pH值6.0时孢子萌发率与与其他处理差异极显著（表4）。

2.5不同杀菌剂对菌落生长的影响

试验结果表明，与对照相比，5种广谱杀菌剂对该菌的生长均有抑制作用（图5）。百菌清对该菌的抑制效果最好，随后依次是扑海因、代森锰锌、霜·锰锌，效果最差的是敌克松。百菌清的抑菌效果与扑海因和代森锰锌无显著差异，与霜·锰锌和敌克松差异极显著。

3结论与讨论

3.1病原菌的分离鉴定

芒萁繁殖力极强，生长发育旺盛，种间竞争力强而排挤其他植物种类的生长与分布，因此在植物群落下层连续成片分布，形成单优层片[17]，从而使病害更容易传播蔓延。目前，还未见对芒萁叶斑病病原菌的报道。本研究通过对芒萁叶斑病病原菌进行分离纯化，利用形态学特征观察并结合分子生物学手段进行分析鉴定[18]，结果表明，两者的鉴定结果相互吻合，初步推测病原菌为拟盘多毛孢属真菌。

3.2病原菌生物学特性

本研究结果表明，该菌对供试的7种氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培养基上生长速度有明显差异，最适该菌生长的氮源是硝酸钠，最适该菌生长的碳源是乳糖。该病原菌适宜生长的温度范围较窄，只能在15～30 ℃范围内生长，最适的生长温度是28 ℃，在10 ℃以下、32 ℃及以上温度条件下停止生长；该病原菌孢子在5～45 ℃范围内均能萌发；有无光照对菌落生长无显著影响，光照有利于分子孢子的萌发；适宜菌丝和分生孢子生长和萌发的pH值范围均较广，菌丝适宜生长的pH值为4.0，分生孢子适宜萌发的pH值为6.0。

3.3广谱杀菌剂对该菌生长的影响

在本研究中5种广谱杀菌剂对该菌落的生长均有抑制作用。百菌清对该菌的抑制效果最好，随后依次是扑海因、代森锰锌、霜·锰锌，效果最差的是敌克松。该菌的生物学特性试验都是在实验室中进行的，相对于自然生长时复杂的生长环境，实验室的环境相对单一，要确定该病害的生物学特性，哪种杀菌剂对该菌的抑制作用最好，还有待开展大田试验进一步证实。

参考文献：

[1]苏育才. 芒萁多糖提取及抗菌活性初步研究[J]. 亚热带植物科学，2005，34（2）：43-45.

[2]苏育才，陈晓清. 芒萁的研究进展[J]. 生物学教学，2012，37（2）：5-7.

[3]阴卓越，张明如，邹伶俐，等. 不同遮阴处理对芒萁冬季光合参数日变化的影响[J]. 福建农林大学学报：自然科学版，2013，42（4）：418-422.

[4]梁晓华，梁晓东，徐成东，等. 云南3种蕨类植物部分生理生化指标的测定[J]. 江苏农业科学，2010，38（4）：378-380.

[5]叶居新，洪瑞川，聂义如，等. 芒萁植株浸出液对几种植物生长的影响[J]. 植物生态学与地植物学学报，1987（3）：203-211.

[6]罗丽萍，葛刚，陶勇，等. 芒萁对几种杂草和农作物的生化他感作用[J]. 植物学通报，1999，16（5）：591-597.

[7]罗丽萍，葛刚，袁宜如，等. 芒萁水提液对几种农作物生长的影响[J]. 南昌大学学报：理科版，1998，22（4）：13-17.

[8]袁宜如，陶勇，葛刚，等. 芒萁水提液对三种受体植物若干生理特性的影响[J]. 南昌大学学报：理科版，2000，24（4）：317-322.

[9]袁宜如，李晓云，邹峥嵘，等. 芒萁水提取物对玉米种子萌发和幼苗生长的影响[J]. 安徽农业科学，2009，37（35）：17434-17435，17459.

[10]汤晓，朱建华. 芒萁根茎黄酮类化合物的提取工艺优化研究[J]. 宁波职业技术学院学报，2008，12（5）：112-115.

[11]丁利君，周圳辉，林燕如. 芒萁中黄酮物质的提取及其抗氧化研究[J]. 食品科学，2005，26（8）：77-82.

[12]方中达. 植病研究方法[M]. 北京：农业出版社，1979.

[13]陆家云. 植物病原真菌学[M]. 北京：中国农业出版社，2001.

[14]张中义. 植物病原真菌学[M]. 成都：四川科学技术出版社，1988：424-436.

[15]巴尼特 H L，亨特B B. 半知菌属图解[M]. 沈崇尧，译.北京：科学出版社，1977：13-25.

[16]王忠文，廖咏梅，陈卫平，等. 中国拟盘多毛孢属的新组合种（Ⅵ）[J]. 广西农业生物科学，2006，21（2）：163-166.

[17]张明如，何 明，温国胜，等. 芒萁种群特征及其对森林更新影响评述[J]. 内蒙古农业大学学报：自然科学版，2010，31（4）：303-308.

[18]Hidaka Y，Kaneda T，Amino N，et al. Chinese medicine，Coix seeds increases peripheral cytotoxic T and NK cells[J]. Biotherapy，1992，5：201-203.朱凤，褚姝频，田子华. 从2014年稻田灰飞虱再度重发谈水稻病毒病的防控对策[J]. 江苏农业科学，2015，43（2）：134-137.