中国人胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤B-RAF基因(V600E)突变的研究

中国人胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤B-RAF基因(V600E)突变的研究

张晓鸽1a，赵建军2a，王庆宇1b，杨蕾2b*

(1.吉林大学第二医院 a电诊科;b研究中心,吉林 长春130041；2.吉林大学中日联谊医院 a呼吸科；b内镜中心)

胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms of the Pancreas，IPMNs)是胰腺癌最重要及最常见的癌前病变之一,约占临床诊断胰腺肿瘤的7%,占偶然发现的胰腺囊肿的50%[1，2]。IPMN分型包括伴轻度不典型增生、IPMN伴中度不典型增生、IPMN伴重度不典型增生及IPMN相关浸润性;不同分型决定着患者的治疗方案和预后[3，4]。目前诊断仅凭病理形态学很难做到IPMN病理诊断及鉴别诊断准确性。急需新的诊断方法以满足临床对于IPMN诊断的需要。当前对IPMN分子分型的研究成为热点，希望从在IPMN发病过程中起重要作用的分子中选择出对IPMN诊断与治疗有重要意义的分子标志物[5]。

鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌性同源体B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)蛋白是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Raf家族的一个成员。这些蛋白激酶是保守的信号转导的膜结合小G蛋白Ras蛋白下游信号通路元件，RAS招募Raf蛋白至细胞膜并刺激使其被激活。活跃B-RAF然后激活第二蛋白激酶MEK，从而激活蛋白激酶ERK。一旦被激活，ERK可进入细胞核，通过磷酸化转录因子，调节相应生物学活动。该基因参与调节基因表达，细胞骨架重排，代谢反应和协调细胞外信号调节细胞增殖，分化，衰老，凋亡，血管生成[6]。BRAF在多种肿瘤存在突变，包括结直肠癌、恶性黑色素瘤、肺癌、甲状腺癌、胰腺癌与肝癌均存在不同比例的突变[7-9]。BRAF其突变位点主要位于基因的第11与15外显子，其中15外显子第1799 位核苷酸上(T突变为 A)，导致其编码的谷氨酸被缬氨酸取代(V600E)尤为重要，该突变可不依赖上游K-RAS的活性而激活下游通路，具有重要的生物学功能[9]。通过分析BRAF基因在IPMN病例的突变情况，探讨相关临床及病理特点与BRAF的基因突变有关联，对评估IPMN恶性程度以及判定是否发生癌变具有重要意义。

1材料与方法

1.1标本资料

收集吉林大学中日联谊医院2012年1月至2014年12月所有的胰腺手术切除肿瘤，经两位高级病理医师重新阅片筛查。共筛查出IPMN 31例入组，IPMN入组标准:以下3条中符合任意1条均可入组。(1)通过检体或者B超以及放射线等影像学检查发现胰腺导管有扩张;(2)病理学检查发现囊性扩张的导管内被覆粘液上皮,或壶腹部有粘液溢出;(3)通过检体或者B超以及放射线等影像学检查发现导管内具有乳头状增生的肿瘤,并伴导管扩张。扩张的导管直径不小于1 cm。所有病理学类型及TNM分期均按照WHO标准。

1.2B-RAF基因(V600E)突变测序分析

获取石蜡组织切片进过二甲苯脱蜡后，收集肿瘤组织，应用DNA提取试剂盒(FFPE gDNA miniPREP KIT,BIOMIGA)进行组织DNA提取.以提取的DNA为模板应用B-raf基因V600E突变检测试剂盒(北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司)通过实时定量PCR仪(罗氏480)进行检测。

1.3统计学分析

应用Fisher’s 卡方检验分析B-RAF基因突变与病理学指标之间关系，以P<0.05为有统计学差异。

2结果

2.1B-RAF基因(V600E)突变检测判定

通过荧光定量PCR检测可见同时出现内参扩增曲线以及检测扩增曲线的为阳性结果，而只出现内参扩增曲线没有检测扩增曲线的为阴性结果，见图1。

A图显示为B-RAF基因(V600E)未突变扩增曲线；B图显示为B-RAF基因(V600E)突变扩增曲线；

2.2IPMN病例基本信息以及基因突变情况

在31例IPMN病例中，男性16例(占51.61%)，女性15例(占48.39%)，平均年龄63.9岁；临床病理分型为胃型15例(占48.39%)，肠型8例(占25.81%)，胰胆管型7例(占22.58%)，嗜酸细胞型1例(占3.22%);侵润型7例(占22.58%)，非侵润型24例(占77.42%)；高分化14例(占45.16%)，中度分化9例(占29.03%)低分化8例(占25.81%)；B-RAF基因突变为2例，占6.45%。具体结果见表1。

表1　IPMN病例基本信息以及B-RAF基因突变情况

23男74胃型否高胰头—24男68胃型否高胰头—25女53胃型否中胰头—26女78肠型是低胰头—27女56胰胆管型是中胰头—28女48胃型否中胰头和胰体—29女74胃型否中胰头和胰体—30男72胃型否高胰头—31男56肠型否高胰头—

+：阳性；—：阴性

2.3B-RAF基因突变与IPMN 病理特点的关系

应用渐进卡方以及精确卡方统计方法评估B-RAF基因突变与IPMN 病理特点的关系，结果显示B-RAF基因突变与临床分型无关(P=0.062)； B-RAF基因突变的IPMN发生侵润的频率(100%)明显高于未突变的IPMN(17.24%)(P=0.045)，B-RAF基因突变的IPMN低分化率(100%)明显高于未突变的IPMN(31.03%)(P=0.046)，见表2。

表2　B-RAF基因突变与IPMN 病理特点的关系

*P<0.05

3讨论

IPMN 是一种胰腺囊性疾病，在临床相对少见，但有可能发展为癌性病变。虽然经过多年的研究，但由于临床、病理等方面的特殊，目前对IPMN的认识不足，使其在诊断、治疗方法均不相同。如能早期诊断及对其进行干预治疗，则预后明显提高。到目前为止IPMN的遗传分析，揭示了在许多相同基因的异常改变常规导管腺癌，包括KRAS基因[10]TP53[11]和CDKN2A/p16基因[12]的突变。

B-RAF基因编码的蛋白属于丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白家族，位于RAS信号下游，在促进细胞增殖方面发挥重要作用。其突变的热点碱基在不同研究中不同。在对胰腺癌热点基因突变的研究中，发现了在胰腺癌的样本中存在B-RAF基因的突变，其主要突变为V600E[8]。而在其他肿瘤热点突变基因筛查中，发现BRAF突变主要发生在核苷酸1850，基因第616密码子改变，导致氨基酸从丝氨酸到苯丙氨酸(S616F)[8，9]。在以往对于B-RAF基因在IPMN样本突变检测中，只是观察到了S616F突变，而没有检测到V600E突变[13-15]。

本研究通过荧光定量PCR技术检测31例IPMN样本的B-RAF基因V600E突变，结果检测到2例样本的突变，突变率为6.25%。通过评估B-RAF基因突变与IPMN 病理特点的关系，结果显示B-RAF基因突变的IPMN发生侵润的频率明显高于未突变的IPMN，B-RAF基因突变的IPMN分化程度明显低于未突变的IPMN。说明B-RAF基因V600E突变可能是预测IPMN发生侵袭以及恶性程度的分子标志物。由于本研究病例数有限，只是初步探讨该基因突变在IPMN发生的频率以及与病理学联系，在此研究基础上应加大研究样本数目，更加明确B-RAF基因V600E突变作为判定IPMN良恶性的分子标志。

参考文献：

[1]Dumlu EG,Karakoc D,Dzdemir A.Intraductal Papillary Mucinous Neoplasm of the Pancreas:Current Perspectives[J].Int Surg，2015，100(6):1060.

[2]Goh BK.International guidelines for the management of pancreatic intraductal papillary mucinous neoplasms[J].World J Gastroenterol，2015，21(34):9833.

[3]Fong ZV,Castillo CF.Intraductal Papillary Mucinous Adenocarcinoma of the Pancreas:Clinical Outcomes,Prognostic Factors,and the Role of Adjuvant Therapy[J].Viszeralmedizin，2015,31(1):43.

[4]Mondal U,Echavarria J,Lee G,et al.Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms of Pancreas:The Good,the Bad,and the Ugly[J].ACG Case Rep J,2015,2(4):204.

[5]Yogi T,Hijioka S,Imaoka H,et al.Risk factors for postoperative recurrence of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas based on a long-term follow-up study:proposals for follow-up strategies[J].J Hepatobiliary Pancreat Sci,2015,22(10):757.

[6]Kolch W.Meaningfu relationships:the regulation of the Ras/Raf/MEK/ERK pathway by protein interactions[J].Biochem J,2000,351，Pt 2:289.

[7]Brose MS,Volpe P,Feldman M,et al.Nicholson ABRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma[J].Cancer Res,2002,62(23):6997.

[8]Davies H,Bignell GR,Cox C,et al.Mutations of the BRAF gene in human cancer[J].Nature,2002,417(6892):949.

[9]Calhoun ES,Jones JB,Ashfaq R,et al.BRAF and FBXW7 (CDC4,FBW7,AGO,SEL10) mutations in distinct subsets of pancreatic cancer:potential therapeutic targets[J].Am J Pathol,2003,163(4):1255.

[10]Z'graggen K,Rivera JA,Compton CC,et al.Prevalence of activating K-ras mutations in the evolutionary stages of neoplasia in intraductal papillary mucinous tumors of the pancreas[J].Ann Surg,1997,226(4):491.

[11]Sasaki S,Yamamoto H,Kaneto H,et al.Differential roles of alterations of p53,p16,and SMAD4 expression in the progression of intraductal papillary-mucinous tumors of the pancreas[J].Oncol Rep,2003,10(1):21.

[12]Biankin AV,Biankin SA,Kench JG,et al.Aberrant p16(INK4A) and DPC4/Smad4 expression in intraductal papillary mucinous tumours of the pancreas is associated with invasive ductal adenocarcinoma[J].Gut，2002，50(6):861.

[13]Schönleben F,Qiu W,Remotti HE,et al.PIK3CA,KRAS,and BRAF mutations in intraductalpapillary mucinous neoplasm/carcinoma (IPMN/C) of the pancreas[J].Langenbecks Arch Surg ,2008,393(8):289.

[14]Chadwick B,Willmore-Payne C,Tripp S,et al.Histologic,immunohistochemical,and molecular classification of 52 IPMNs of the pancreas[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2009,17(1):31.

[15]Schönleben F,Qiu W,Bruckman KC,et al.BRAF and KRAS gene mutations in intraductal papillary mucinous neoplasm/carcinoma (IPMN/IPMC) of the pancreas[J].Cancer Lett,2007,249(2):242.

(收稿日期：2015-02-19)

文章编号：1007-4287(2015)12-2077-04

*通讯作者

基金项目：吉林省科技厅项目(201215074)