实时定量PCR检测KIR转录水平的方法构建

陈　鸥，陈会会，姜拥军，尚　红*

(1.中国医科大学附属第一医院 检验科 艾滋病研究所，辽宁 沈阳110001;2.中国医科大学附属第四医院 检验科)

实时定量PCR检测KIR转录水平的方法构建

陈鸥1，2，陈会会1，姜拥军1，尚红1*

(1.中国医科大学附属第一医院 检验科 艾滋病研究所，辽宁 沈阳110001;2.中国医科大学附属第四医院 检验科)

摘要：目的构建可定量检测杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)转录水平的方法。方法筛选KIR3DS1和KIR3DL1保守区特异性引物，利用RT-PCR和熔解曲线法对引物特异性进行检验，建立可定量的标准内参，应用SYBR Green RT-PCR方法检测标本中KIR3DS1和KIR3DL1的mRNA含量。结果通过电泳和实时定量PCR的熔解曲线明确了KIR3DS1和KIR3DL1引物，其特异性好，无杂带。应用TA克隆建立的KIR定量标准品线性关系好，可检测待测物的范围大。应用临床标本可检测出两组标本有显著差异，符合临床预期。结论本文建立的KIR mRNA定量检测方法，可以定量检测活化和抑制性KIR,可以进一步研究不同疾病进展的机制以及预测疾病的临床转归。

关键词：KIR基因；KIR3DS1；KIR3DL1；实时定量PCR

(ChinJLabDiagn,2015,19:2030)

杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)是一组主要表达在淋巴细胞表面的分子，属于免疫球蛋白受体家族，在淋巴细胞识别“自己”与“非己”及杀伤功能的调节中起着极其重要的作用，其配体为人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)Ⅰ类分子。KIR有2种类型，即活化性KIR和抑制性KIR，与细胞表面HLA-Ⅰ类分子相互作用，抑制或者活化细胞毒活性，调控免疫应答过程[1]。

KIR等位基因数目和类型会直接影响病毒感染、多种自身免疫性疾病的发生和骨髓、器官移植以及造血干细胞移植的存活[2,3]。

与KIR基因的数目和类别相比较，KIR转录水平更能贴切地反映与疾病进展的关系。Pavel Bostik等,报道高水平的SIV的复制与增长的KIR3DL mRNA表达水平密切相关[6]； Galit Alter et al报道，在急性HIV感染时，活化性KIR的mRNA水平增高；在慢性HIV感染时，抑制性KIR的mRNA增高[7]。但目前国人KIR mRNA水平的定量检测还少有报道，其检测方法建立，对研究国人KIR的表达水平与各种疾病进程的关系，为寻找有效的防治方法提供的技术保障。

1材料与方法

1.1细胞及试剂外周血单个核细胞来自艾滋病患者和正常体检人群，总RNA提取试剂用QIANGEN RNA试剂盒，反转录试剂盒用ImProm-ⅡTMReverse Transcription System (Promega)，实时定量PCR试剂盒采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)。

1.2方法

1.2.1外周血单个核细胞和RNA的提取取EDTA抗凝外周血5 ml，常规Ficoll密度梯度法离心获PBMC。用QIAGEN试剂盒提取细胞总RNA,经紫外分光光度计和 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定浓度和纯度后-80 ℃ 储存备用。

1.2.2逆转录反应按PROMEGE 公司的Improm-ⅡTM Reverse Transcriptim System 说明书进行操作。取已经提取好的RNA 1 μg(4.5 μl)加入Oligo dt 0.5 μg(0.5 μl),70℃ 5 min，冰浴>5 min。配置逆转录体系，去离子水7 μl,buffer 4 μl,Mgcl21 μl,dNTP 1 μl,RNA抑制酶0.5 μl,逆转录酶1 μl。反应条件：25℃ 5 min,42℃ 60 min,70℃ 15 min,4℃。 将获得的cDNA于-80 ℃储存备用。

1.2.3引物的设计从GenBank上下载KIR3DS1和KIR3DL1的核苷酸序列，使用PRIMER 5.0软件在引物的保守区设计引物。引物序列为：KIR3DS1 F:5’-CAGCGCTGTGGTGCCTCGC-3’,KIR3DS1R:5’-CTGTGACCATGATCACCAT-3’ KIR3DL1F:5’-GGACATCGTGGTCACAGGTCC-3’ KIR3DL1R:5-CACTGAGGTCCCAATCAGAATG-3；GAPDH：F:5’-ACCGGGAAGGAAATGAATGG-3’ R:5’-GCAGGAGCGCAGGGTTAGT-3’

1.2.4KIR定量标准品的制备将-80℃冻存的cDNA经过普通PCR扩增后，切胶纯化，选用TAKARA公司的PMD18T载体进行TA克隆。过夜连接后，进行转化。取感受态细胞100 μl置于冰上融化，取5 μl连接后产物冰上加入100 μl感受态细胞，冰上30 min，42℃ 90 s，从ep管中转移感受态到有400 μl SOC培养基的管中，将100 μl产物涂于LB培养皿中，过夜培养。之后用干净的枪尖挑取单个菌落后摇菌。质粒小提后进行鉴定。测序鉴定产物的正确性。并用紫外分光光度计测定质粒的浓度，OD260/OD280在1.7-1.9之间。

1.2.5标准曲线的制备选用TAKARA公司的SYBR GREEN 试剂盒进行检测。将质粒KIR3DS1,KIR3DL1,GAPDH按5个浓度梯度1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000进行稀释后进行检测。检测反应体系为:Real Master Mix加入25 μl，DEPC水18 μl，Rox reference dye 1 μl,上下游引物分别为1 μl。反应条件为：95℃ 30 s,1个循环，95℃ 30 s,60℃ 34 s 40个循环。

1.2.6统计学分析用SPSS软件17.0进行分析。分析健康对照者，病毒感染者各基因表达水平的不同，并计算P值。

太阳能制冷系统分为集热系统和制冷系统两部分。集热系统是对太阳能进行收集，并且将收集的太阳能用来驱动吸收式制冷。集热系统图如图1，制冷系统图如图2所示。

2结果

2.1KIR定量标准品特异性分析用含有GAPDH,KIR3DS1,KIR3DL1的质粒进行PCR扩增并以1%琼脂糖凝胶进行电泳，结果如下图(见图1)。当退火温度为56℃时，尚有很浅的非特异性条带。后续实验中将退火温度由56℃提升至60℃时，引物的特异性很好。从图中可见，条带清晰，片段长度正确。从RT-PCR角度说明引物的特异性高。测序结果与GENEBANK序列符合(G代表GAPDH,S代表KIR3DS1，L代表KIR3DL1)。

图1　含GAPDH,KIR3DS1,KIR3DL1质粒的PCR扩增及1%琼脂糖凝胶电泳图

2.2目的基因和管家基因熔解曲线从图中可见，熔解曲线出现单独特异性峰，也从实时定量PCR的角度说明引物特异性高(见图2)。

2.3标准曲线分别将目的基因和管家基因进行1∶103，1∶104，1∶105，1∶106，1∶107进行倍比稀释后，用实时定量PCR进行检测，软件将不同稀释倍数稀释点得到的不同CT值绘制成一条直线即为标准曲线。结果显示标准曲线线性关系很好(见图3)。

图2AKIR3DL1的溶解曲线图2BKIR3DS1的溶解曲线图2CGAPDH的溶解曲线

图2目的基因和管家基因熔解曲线

图3　管家基因标准曲线

2.4KIR3DL1 mRNA实时定量检测选取正常对照和病毒感染者两组，分离外周血单个核细胞，提取RNA，定量检测KIR3DL1 mRNA水平，发现病毒感染组KIR3DL1 mRNA水平显著高于正常对照，P=0.0338(见图4)。

图4　KIR3DL1 mRNA在感染者和正常人的检测

2.5KIR3DS1 mRNA实时定量检测选取疾病处于不同阶段的A、B两组，比较KIR3DS1 mRNA定量水平，发现存在差异(P=0.0101)(见图5)。说明上述检测方法，可以针对病毒感染或疾病进展的不同阶段进行加以区分。

图5　KIR3DS1 mRNA在疾病不同阶段的检测

3讨论

目前对于KIR mRNA的研究，报道较少。有国外文献报道，KIR转录物水平在慢性HIV感染者中明显高于急性感染者和正常对照组。这可能是由于HIV病毒的复制对KIR的激活所致。其中抑制性的KIR在慢性HIV-1感染者中含量是非常高的，在急性感染者中活化的KIR显著高于正常对照组[8]。Ravet等研究了暴露未感染者(EU)和静脉吸毒途径的HIV感染者和正常对照者KIR等位基因的表达量。发现KIR2DL3的转录物水平在EU和对照组中低于HIV阳性组，而联合KIR2DS2-/2DL2-/2DL3+在EU组中明显高于HIV感染组，并且KIR3DL1水平在EU组中明显低于IDU组[9]。

活化性KIR转录水平的增加会促进淋巴细胞的增殖，导致IFN-γ和颗粒酶等细胞因子释放增加，从而延缓疾病进程。而抑制性KIR转录水平的增加会抑制淋巴细胞的功能，使病毒感染性疾病不断进展。因此检测不同KIR转录水平，可以预测疾病转归。

本文建立的KIR mRNA定量检测方法，选取了最佳引物序列和退火温度，从而提高了引物的特异性，电泳结果显示引物条带清晰。从熔解曲线上看，引物出现单独特异性峰，再一次证明了引物的特异性高。首次通过TA克隆建立的KIR定量标准品，稀释不同浓度，线性关系好，故可检测范围广，标本水平差异大也可适用。国外文献中对KIR 的检测多采用探针方法，本实验构建的KIR定量检测方法特异性好，故采用SYBR Green 方法又降低了实验成本。

本实验构建了定量检测活化和抑制性KIR的实验方法,为进一步研究不同疾病进展的机制以及预测疾病的临床转归提供了新思路。

参考文献：

[1]Hamerman JA,Ogasawara K,Lanier LL.NK cells in innate immunity[J].Curr Opin Immunol，2005，17(1):29.

[2]Martin AM,Freitas EM,Witt CS,et al.The genomic organization and evolution of the natural killer immunoglobulin-like receptor (KIR) gene cluster[J].Immunogenetics,2000,51:268.

[3]Moretta L,Bottino C,Pende D,et al.Different checkpoints in human NK-cell activation[J].Trends Immunol,2004,25(12):670.

[4]De Re V,Caggiari L,De Zorzi M，et al.Genetic diversity of the KIR/HLA system and susceptibility to hepatitis C virus-related diseases[J].PLoS One,2015,10(2):117.

[5]Hershberger K L,Shyam R,Miura A，et al.Diversity of the killer cell Ig like receptors of rhesus monkeys[J]．J Immunol,2001,166：4380．

[6]Martin MP,Gao X,Lee JH,et al.Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS[J].Nat Genet,2002,31(4):429.

[7]Kulkarni S.The Yin and Yang of HLA and KIR in human disease[J].Semin Immunol,2008,6:3．

[8]Galit Alter,Suzannah Rihn,Katharine Walter，et al.HLA Class I Subtype-Dependent Expansion of KIR3DS1 and KIR3DL1+NK Cells during Acute Human Immunodeciency Virus Type 1 Infection[J].J Virol,2009,83(13):6798.

[9]Ravet S,Scott-Algara D,Bonnet E,et al.Distinctive NK-cell receptor repertoires sustain high-level constitutive NK-cell activation in HIV-exposed uninfected individuals[J].Blood,2007,109(10):4296.

Method construction of quantitative real-time PCR for detecting KIR mRNA levelsCHENOu1,2,CHENHui-hui1,JIANGYong-jun1,etal.(1.LaboratouyofAIDSResearch,DepartmentofLaboratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,FourthAffiliatedHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110032,China)

Abstract:To build quantitative real-time PCR for detecting (Killer cell Ig-like receptors，KIR) mRNA levels with SYBR Green method,we screened primers of KIR3DS1 and KIR3DL1 that aimed at the specific conservative region.Our experiment used PCR,electrophoresis and melting curve to find out the specificity of the primers and set up quantitative standard reference.Then we applied TA clone to build KIR quantitative standard reference which had a good linear relationship and a large detection range.Patients’ samples were tested with statistical differences between two groups and the results were in accordance with clinical expectation.In conclsion:the method we built can quantitatively detect both active and inhibitive mRNA levels of KIR and can people further understand the progress and clinical outcome of diseases.

Key words:KIR;real-time PCR;KIR3DS1;KIRSDL1

(收稿日期：2015-02-18)

文献标识码：A

中图分类号：R512.91

文章编号：1007-4287(2015)12-2030-04

*通讯作者

基金项目：国家科技重大专项课题资助(2008ZX10001-001)