远程肢体缺血后适应对大鼠海马区TLR4和IL-6表达水平的影响

张　江,周　涛,王大力,刘会英

(华北理工大学附属医院 神经内科二病区,河北 唐山063000)

远程肢体缺血后适应对大鼠海马区TLR4和IL-6表达水平的影响

张江,周涛,王大力,刘会英

(华北理工大学附属医院 神经内科二病区,河北 唐山063000)

摘要：目的观察大鼠远程缺血后适应时海马CA1区TLR4、IL-6表达变化并探讨其意义。方法72只雄性SD大鼠随机分为假手术组、对照组、远程缺血后适应组，各组又分为12 h、24 h、48 h、72 h各时间点组，每组6只。应用改良Longa法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型并以此为对照组，在再灌注即刻用止血带结扎/放松双后肢根部各30 min循环3次，作为远程缺血后适应处理方法。HE染色观察大鼠海马CA1区组织病理学变化，免疫组织化学染色观察大鼠海马CA1区TLR4和IL-6的表达。结果在大鼠海马CA1区，远程缺血后适应组神经元缺失、细胞肿胀较对照组明显减轻。与假手术组相比，对照组与远程缺血后适应组TLR4和IL-6表达明显增高(P<0.05)；且远程缺血后适应组TLR4和IL-6的表达较对照组明显减少(P<0.05)。结论远程缺血后适应具有脑保护作用，这种作用可能与抑制TLR4和IL-6表达有关。

关键词：远程缺血后适应；TLR4；IL-6；表达

(ChinJLabDiagn,2015,19:2001)

远程缺血后适应[1]是指器官缺血后，对远隔器官进行短暂的轻度的缺血再通，可起到保护作用。研究表明肢端缺血可以减少海马CA1区的延迟神经元损伤[2]。但其机制尚不清楚。ILR4为人体固有免疫的触发因子[3]，参与介导对抗病原体的一系列炎症反应，诱导促炎性细胞因子IL-6等的释放。鉴于上述过程是缺血再灌注损伤的重要机制之一[4]，本实验在此基础上，探讨了远程缺血后适应的脑保护作用与TLR4和IL-6表达的关系。

1材料与方法

1.1动物分组及模型制备72只健康雄性SD大鼠(自北京华阜康生物科技股份有限公司购买,实验动物使用许可证编号：SCXK(京)2009-2004)，体重250 g-300 g，随机分为假手术组(S组)、对照组(C组)、远程缺血后适应组(P组)，各组分为12 h、48 h、24 h、72 h共4个时间点组，每组6只大鼠。应用改进的Longa[5]法，建立右侧脑缺血再灌注模型。大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，小心分离右侧颈总动脉和颈外动脉，线栓由颈总动脉进入颈内动脉至大脑中动脉，线栓头端距血管分叉处约18 mm。2 h后再次麻醉大鼠，C组直接拔除线栓；P组在拔除线栓后即刻用止血带扎紧双侧后肢根部，扎紧/松开各10 min循环3次，此为RIP。假手术组只分离出各动脉，不置入线栓。以大鼠麻醉清醒后出现对侧肢体瘫痪为标准。参照Zea Longa[5]的5分制评分标准，剔除评分为0分和4分的大鼠，保证各小组6只不变。

1.2HE染色及免疫组化染色分别于各时间点将大鼠深度麻醉后，用4%多聚甲醛溶液行心脏灌流，断头取脑后行外固定。鼠脑做约2 mm冠状切片，常规石蜡包埋，制成厚约4 μm的切片，取海马最大的冠面切片用于HE染色和免疫组化染色。

1.2.1HE染色依照常规方法脱蜡、染色、脱水、透明、封片后，光镜下观察。

1.2.2免疫组化染色TLR4和IL-6抗体均为兔抗大鼠、小鼠、人多克隆抗体(由北京博奥森生物有限公司)，稀释度均为1∶200；PV6001试剂盒购自于北京中杉金桥生物技术有限公司。应用常规PV法：脱蜡至去离子水，枸橼酸修复缓冲液行抗原高压热修复，自然冷却至室温，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶10 min，PBS缓冲液洗涤3 min×3次，滴加特异性抗体，4℃孵育过夜，PBS缓冲液洗涤3 min×3次，PV6001试剂盒中的试剂(抗兔抗体酶复合物)37℃孵育30 min，再次PBS缓冲液洗涤3 min×3次，DAB镜检控制显色，流水冲洗3 h以上去除DAB残留物，苏木素复染，脱水、透明封片。光镜下观察。用PBS代替一抗作为阴性对照，以胞浆为棕黄色为阳性。每只大鼠取连续4张相同部位的切片，每张切片在200倍光镜下随机取海马CA1区的6个不同视野，通过Motic Med 6.0数码医学图像分析系统统计每个视野的免疫组化阳性细胞数，取其平均数为该大鼠阳性细胞的表达数量。

2结果

2.1各组大鼠海马CA1区HE染色结果S组大鼠海马结构清晰，CA1区细胞形态正常，排列整齐，胞质染色均匀，胞核浅蓝色，圆形或椭圆型，核仁明显，核膜清晰(图1)。C组大鼠海马结构松散，CA1区细胞稀疏，神经元明显减少，可见较多的神经元胞体缩小，胞浆浓缩深染，胞核固缩，核仁核膜消失；也有的神经元肿胀淡染，呈三角形或者梭形；有的胞浆出现大片空泡区，提示脑水肿严重；有些区域出现小片坏死，细胞核碎裂甚至溶解消失(图2)。P组大鼠海马结构欠完整，但较C组神经元缺失减少，胞体缩小深染现象明显改善，神经元肿胀减轻(图3)。

图1假手术组图2对照组图3远程缺血后适应组

2.2各组大鼠海马CA1区免疫组化染色结果阳性结果判定：海马CA1区的TLR4及IL-6阳性细胞表达为胞浆呈棕黄色，胞核呈浅蓝色或紫蓝色。

2.2.1TLR4染色结果在海马CA1区，S组各时间点TLR4表达水平均低。C组与P组TLR4表达较S组明显增高(P<0.05)。在C组，TLR4表达12h开始表达，24h达到高峰，72h开始下降。P组TLR4阳性表达在72h前均低于C组(P<0.05)，而72h时略高于C组，但无统计学意义(P>0.05)。实验结果提示缺血再灌注时，大鼠海马CA1区TLR4被激活，但远程缺血后适应使TLR4的激活受到抑制而延迟。(表1)

表1　各组大鼠海马CA1区TLR4阳性细胞表达数比较±s)

注：各观察时间点n=6；*与假手术组比较P<0.05；△与对照组比较P<0.05。

2.2.2IL-6染色结果阳性结果判定同上述，在海马CA1区，S组各时间点IL-6仅有少量表达。C组与P组有明显的IL-6表达，与S组相比均有统计学意义(P<0.05)。IL-6在C组12 h开始表达，48 h达到高峰，72 h开始下降。P组IL-6阳性细胞表达在各时间点均低于C组，有显著统计学意义(P<0.05)。实验结果提示缺血再灌注时，大鼠海马CA1区的IL-6被激活，但远程缺血后适应使IL-6的激活受到抑制。(表2)

表2　各组大鼠海马CA1区IL-6阳性细胞表达数比较±s)

注：各观察时间点n=6；*与假手术组比较P<0.05；△与对照组比较P<0.05。

3讨论

缺血再灌注所致的脑损伤，已被证明是影响关于血管再生预后的重要因素[6]，许多研究者都致力于寻找新的药物和方法来保护脑组织免受缺血再灌注损伤。早在50多年前，Sewell[7]及其同事就曾报告,间歇的再灌注(相当于目前的缺血后处理),可以废除心室颤动。直到2003年Z.Q Zhao[8]等人提出“缺血后适应”这一假说后，缺血后适应的概念引起越来越多的重视。而如今，经典的缺血后适应已经延伸包括药理学后适应和远程缺血后适应。最早发现可以实施远程缺血后适应的器官为肾脏，由Kerendi等[2]通过短暂夹闭小鼠肾动脉而实现对小鼠缺血心肌的保护作用。接着肢体远程缺血后适应的心肌保护作用也得到证实[9]。在脑缺血的研究中，也已有研究提示肢体的缺血后适应在具有神经保护作用[10]。

对于远程缺血后适应的机制少有报道，目前普遍认为远程缺血后适应的脑保护作用在于通过肢端、肾脏等短暂的缺血再灌注使心脏或脑产生对随后而来的较严重缺血再灌注损伤的耐受能力，而缺血再灌注损伤的重要机制之一为免疫炎症反应，TLR4则是免疫炎症反应的重要环节，内源性配体与TLR4结合后发生结构改变，并募集髓样分化蛋白88(Myeloid differentiation protein 88,MyD88)等转接蛋白，通过MyD88依赖或非依赖性信号转导通路激活转录因子NF-κB和干扰素相关蛋白(interferon binding protein，IRFs),进而诱导产生TNF-α,IL-1β和IFN-β等一系列炎症细胞因子[11]。已有实验证明，在树鼩血栓性脑缺血的模型[12]中,缺血后适应4 h及24 hTLR4蛋白表达减少，提示缺血后适应可能与调控TLR4表达有关。

本研究实验结果显示，大鼠脑缺血再灌注后12 h时TLR4和IL-6的表达已经开始开始增高，提示缺血再灌注损伤炎症反应在12 h已经启动，TLR4和IL-6表达分别于24 h、48 h达到高峰，与对照组相比，远程缺血后适应组TLR4表达在12 h、24 h、48 h均受抑制，提示远程缺血后适应的脑保护作用与抑制TLR4表达有关，而在72 h表达水平与对照组相当，可能与脑缺血后期脑组织的自身修复有关。IL-6在远程缺血后适应中的表达于各时间点都低于对照组，提示其激活在远程缺血后适应中受到抑制。

通过本实验可以推断远程缺血后适应可以通过抑制TLR4、IL-6相关的炎症反应实现脑保护作用，为进一步明确远程缺血后适应的分子机制以及临床应用提供了依据。

参考文献：

[1]Gao XW,Ren CC,Zhao H.Protective Effects of Ischemic Postconditioning Compared With Gradual Reperfusion or Preconditioning[J].Journal of Neuroscience Research，2008,86:2505.

[2]Kerendi F,Kin H,Halkos ME,et al.Remote postconditioning:Brief renal ischemia and reperfusion applied before coronary artery reperfusion reduces myocardial infarct size via endogenous activation of adenosine receptors[J].Basic Res Cardiol,2005,100:404.

[3]A.F.Mc Gettrick and L.A.J.O’Neill.Toll-like receptors:key activators of leucocytes and regulator of haematopoiesis[J].British Journal of Haematology,2007,139:185.

[4]Qing W,Xiannan,Midori A,Yenari.The inflammatory response in stroke[J]．J Neuroimmunol,2007,18491-20:53-68.

[5]Zea Longa E,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]．Stroke,1989,20:84.

[6]Tjoumakaris SI,Jabbour PM,Rosenwasser RH.Neuroendovascular manage-ment of acute ischemic stroke[J]．Neurosurg Clin N Am,2009,20:419.

[7]Sewell WH,Koth DR,Huggins CE.Ventricular fibrillation in dogs after sudden return of flow to the coronary artery[J]．Surgery,1955,38(6):1050.

[8]McClanahan T,Nao B,Wolke L,et al.Brief renal occlusion and reperfusion reduces myocardial infarct size in rabbits[J]．FASEB J,1993:7.

[9]Li CM,Zhang XH,Ma XJ,et al.Limb ischemic postconditioning protects myocar-dium from ischemia-reperfusion injury[J].Scand Cardiovasc J,2006,40:312.

[10]卢旭霞,牛小媛,罗玉敏,等.远程缺血后适应对大鼠脑缺血-再灌注损伤的影响[J].中国脑血管病杂志,2013,7[3]:139.

[11]N Zou,L Ao,Cleveland Jr,et al.Critical role of extracellular heat shock cognate protein 70 in the myocardial inflammatory response and cardiac dysfunction after global ischemia reperfusion[J].American Journal of Physiology,2008,294:2805.

[12]冯蕊，李树清.缺血后适应对脑缺血树鼩海马TLR4表达的影响[J]．中国病理生理杂志,2011,27:1048.

The effect on the expression of TLR4 and IL-6 in the hippocampus of rats after the remote limb isehemic postconditioningZHANGJiang，ZHOUTao,WANGDa-li,etal.(NO.2DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the changes of TLR4 and IL-6 expression in rats hippocampus CA1 region in remote ischemic postconditioning(RIP) and explore its significance.MethodsAll the 72 male SD rats were divided into Sham group,Contrast group and RIP group randomly.Each group was divided into 4 time points:12 h,24 h,48 h and 72 h group.There were 6 rats in each group.Use the cerebral ischemia-reperfusion model which was established with modified longa method as the contrast group.The method of RIP was to Fasten rats Posterior limbs by a tourniquet for 30 min immediately,then relax them for 30 min， repeat 3 times.To observe the pathological variation of hippocampus CA1 region by HE dyeing；to test the expression of TLR4 and IL-6 by immunohistochemical staining.ResultsCompared to contrast group,neuronal loss and swelling reduced significantly in RIP group.Compared to sham group,the TLR4 and IL-6 expression in contrast group and RIP group increased significantly(P<0.05).Compared to contrast group,the TLR4 and IL-6 expression in RIP group reduced significantly(P<0.05).ConclusionRIP dose have protective effect on cerebral ischemia.The effect may be associated with the inhibition of TLR4 and IL-6 expression.

Key words:Remote ischemic postconditioning；TLR4；IL-6；expression

(收稿日期：2015-01-20)

作者简介：张江(1971-)，男，硕士研究生，主任医师，教授，硕士研究生导师，副主任，研究方向：脑血管疾病。

文献标识码：A

中图分类号：R743.3

文章编号：1007-4287(2015)12-2001-04