高迁移率族蛋白1在呼吸机相关性肺损伤大鼠中的表达变化

马杰飞　何义舟　罗哲　屠国伟

(复旦大学附属中山医院重症医学科，上海　200032)



·论著·

高迁移率族蛋白1在呼吸机相关性肺损伤大鼠中的表达变化

马杰飞何义舟罗哲屠国伟

(复旦大学附属中山医院重症医学科，上海200032)

摘要目的：探讨呼吸机相关性肺损伤(ventilator-induced lung injury， VILI)大鼠肺组织中高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1, HMGB1)的表达变化。方法： 将24只成年SD大鼠随机分为3组，每组8只。对照组：自主呼吸；大潮气量组：潮气量(TV)=30 mL/kg；丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate, EP)干预组：尾静脉注射EP(100 mg/kg)，机械通气模式同大潮气量组。采用Western blotting、RT-PCR、ELISA检测大鼠血清、肺泡灌洗液、肺组织以及牵张24 h后肺泡巨噬细胞的培养液中的HMGB1以及炎性因子的水平。结果：大潮气量组大鼠血清、肺泡灌洗液及肺组织中HMGB1含量较对照组增加。体外肺泡巨噬细胞培养液中的HMGB1在机械牵张的作用下也呈现上升趋势。EP干预后，VILI大鼠肺组织中HMGB1减少，且细胞凋亡信号通路相关蛋白Caspase3、 Caspase9和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)表达增加。结论：VILI大鼠模型中HMGB1的表达增加，可能与肺泡巨噬细胞受机械牵张有关；EP干预对VILI肺组织有一定保护作用。

关键词呼吸机相关性肺损伤；高迁移率族蛋白1；丙酮酸乙酯

基本项目：上海市卫生和计划生育委员会基金项目(编号：201440333)复旦大学附属中山医院青年科学基金(编号：2013ZSQN/29)

呼吸机相关性肺损伤(ventilator-induced lung injury, VILI)是机械通气(mechanical ventilation, MV)的严重并发症[1-2]。最近研究[3]显示，炎性反应在VILI发生发展过程中起着十分重要的作用。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein, HMGB1)是一类参与DNA重组修复的DNA结合蛋白，它作为炎性反应晚期介质，能够调节其他炎性因子的分泌，在炎性反应中发挥重要作用[4]。但是HMGB1参与VILI发病的机制目前仍不明确，也未见将HMGB1作为靶点干预VILI的相关研究。我们通过研究VILI模型中HMGB1的表达变化、可能的机制及丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate, EP)对其的干预效果，企盼为VILI的发病机制和治疗提供依据。

1资料与方法

1.1一般资料成年SD雄性大鼠24只，体质量200~250 g(上海市斯莱克实验动物有限公司提供)。HMGB1(货号：ab77302)抗体购自英国Abcam公司，GAPDH(货号：G8795)抗体购自美国Sigma Aldrich公司；Caspase 3(货号：9665)、Caspase9(货号：9509)与PARP(货号：5625)购自德国CST公司；ELISA试剂盒购自美国Millipore公司。PCR引物由上海Sagon公司合成。

1.2分组及模型构建将24只大鼠随机分成3组，每组8只。对照组：保留自主呼吸；大潮气量组：潮气量(TV)=30 mL/kg，风险比(RR)=40次/min，吸呼比(I∶E)=1∶3，呼气末正压(PEEP)= 0，吸入氧浓度(FiO2)=21%；EP干预组：尾静脉注射EP 100 mg/kg, 机械通气模式同大潮气量组。大潮气量组和EP干预组大鼠在通气期间每60 min将鼠台向左或右倾斜，改变大鼠体位10~15 min，使肺各部位通气均匀，整个过程中维持室温26~28℃。实验时按出血量和生理需要量维持补液(乳酸林格氏液，1 mL/kg)，定时加用麻醉药和肌松药。实验结束后处死实验鼠，再提取其肺组织及细胞，经HE染色检测VILI模型是否构建成功。

1.3细胞机械牵张大鼠肺泡巨噬细胞培养于含有10%胎牛血清(FBS)、1% 青霉素-链霉素的DMEM培液中，细胞置于37℃，CO2体积分数为5%的环境中培养，待细胞贴壁生长至70%~80%融合后，进行机械牵张。机械牵张的拉伸应变率为20%，频率为30次/min，牵拉/松弛力为1∶1，牵张24 h。随后对细胞进行检测，以未施加牵张应力的肺泡巨噬细胞为对照。

1.4标本采集及检测

1.4.1血标本采集对照组于气管切开30 min，自主通气1、2、3、4 h，另两组于机械通气前、机械通气1、2、3、4 h时，用肝素化的注射器经股动脉导管抽取0.2 mL全血，在室温下行动脉血气分析。实验结束后经腹主动脉一次性抽取4 mL全血，于4℃、3000 r/min离心10 min后取上清液，置于-80℃冻存、待测。

1.4.2肺组织标本采集及制备机械通气4 h后(对照组气管切开4 h)，经动脉放血处死大鼠， 迅速打开胸腔并结扎右侧主支气管，取出右肺上叶置于4%中性甲醛中固定，然后取右肺下叶置于EP管中，-80℃冻存，用剩余右肺组织计算肺组织湿/干质量比(W/D)。取冻存的肺组织标本，用磷酸盐溶液(PBS)冲洗3次，按照100 mg/mL的比例把肺组织置入PBS中，用电动匀浆机制成匀浆，以4℃、12000 r/min离心20 min后取上清液，置于-80℃冻存待测。

1.4.3蛋白及mRNA检测采用Western blot ting法检测肺组织和细胞中HMGB1等蛋白的表达，以GAPDH作为内参；用反转录PCR(RT-PCR)检测肺组织和细胞中的mRNA含量，以GAPDH作为内参；用ELISA试剂盒检测血清和细胞灌洗液中HMGB1的浓度。

2结果

2.1大鼠VILI模型的构建HE染色结果显示，与对照组(图1A)相比，大潮气量组VILI大鼠模型肺部组织形态不规整，有较多破裂肺泡，并有的巨噬细胞浸润(图1B)。与对照组比较，大潮气量组大鼠的肺泡灌洗液中的炎性因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、IL-6、IL-10、干扰素-γ(INF-γ)表达升高(图1C)。上述结果表明，大鼠VILI模型构建成功。

2.2HMGB1在VILI模型中的表达变化与对照组比较，大潮气量组大鼠的血清和肺泡灌洗液中HMGB1的mRNA或蛋白含量增加(图1D、E、F)。

2.3机械牵张对肺泡巨噬细胞中HMGB1表达的影响对肺泡巨噬细胞施加20%牵张强度后，与未受牵张细胞相比，受机械牵张肺泡巨噬细胞的培养液中TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10增多(图2A)，HMGB1蛋白表达增加(图2B)。

2.4EP干预对VILI的影响肺组织HE与TUNEL染色显示，EP干预后，肺泡形态较为规整，且细胞凋亡明显增加(图3A)；ELISA结果显示，EP干预后，肺泡灌洗液中炎性因子表达减少(图3B)。

2.5EP干预抑制HMGB1的表达并激活细胞凋亡信号通路EP干预后，肺组织HMGB1的表达减少(图4A)，细胞凋亡信号通路的关键蛋白Caspase3、 Caspase9和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白的表达增加(图4B)。

A：对照组肺组织HE染色结果；B：大潮气量组肺组织HE染色结果；C、D：ELISA检测结果；E：肺组织RT-PCR检测结果；F：肺组织的Western blotting结果。与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

图1HMGB1在VILI大鼠模型中的表达变化

A：ELISA检测结果；B：Western blotting 结果，与未牵张细胞比较，**P<0.01

图2机械牵张对肺泡巨噬细胞HMGB1表达的影响

图3　EP干预对VILI的影响

图4　EP干预抑制HMGB1的表达并

3讨论

巨噬细胞及炎性因子在VILI发生发展过程中发挥着重要作用。研究[5]发现，肺泡巨噬细胞在机械牵张早期即可被激活并成为炎性因子的主要来源。而本研究证实VILI模型大鼠血清和肺泡灌洗液中HMGB1含量增加，为了研究这种变化是否与由肺泡巨噬细胞受到机械牵张有关，我们构建了肺泡巨噬细胞机械牵张模型，结果表明肺泡巨噬细胞细胞表达的HMGB1、TNF-α、IL-4等炎性因子均增加，证实VILI中HMGB1的增加与肺泡巨噬细胞相关。

HMGB1是一种DNA结合蛋白，参与DNA的重组、修复等生命活动。1999年Wang等[6]首次报告，HMGB1作为一种晚期炎性介质参与了脓毒症的发病过程，而后一系列的研究表明，HMGB1是严重感染所致多器官功能障碍综合征(MODS)的重要炎性介质。有研究[4]指出，巨噬细胞、树突状细胞、垂体细胞、上皮细胞、肝细胞等受脂多糖(LPS)、INF-γ、生物活性脂等诱导后，胞内HMGB1可被主动分泌到细胞外。在机械通气过程中，大潮气量通气、高气道压等损伤因素均可导致VILI的发生，而这些因素可直接损伤各种细胞或间接激活上皮细胞、内皮细胞或炎性细胞的细胞信号通路，造成各种细胞内介质的释放，因而VILI其本质上来说也是一种炎性过程，而HMGB1作为一种炎性介质是否参与VILI的发生则需要进一步研究。本研究发现，VILI大鼠模型的肺泡灌洗液、血清及肺泡巨噬细胞培养液中HMGB1含量均上升，证实了上述假设。

美国食品和药物管理局(FDA)已将EP列为安全药物，并已通过临床I期试验，安全性和稳定性得到了肯定，目前II 期试验正在进行中。本研究中，EP干预后，VILI大鼠肺泡形态及肺泡灌洗液中TNFα、IL-4等炎性因子减少，表明EP干预对VILI对肺部的炎性反应具有一定抑制效果。Ulloa等[7]发现EP可抑制BALB/c小鼠巨噬样细胞RAW264.7株中TNFα和HMGB1的释放。本研究发现，EP干预后，VILI大鼠肺组织中HMGB1的表达减少，并使一系列细胞凋亡信号通路中的关键蛋白升高，如Caspase3、Caspase9和PARP。因此，我们认为，EP干预对VILI具有保护作用。

综上所述，VILI大鼠肺组织及血清中HMGB1的含量增加，说明机械牵张会促使肺泡巨噬细胞HMGB1的高表达并向外周组织释放。EP干预可以明显抑制VILI大鼠肺组织HMGB1的表达，并激活细胞凋亡通路，从而对VILI肺组织具有一定保护作用。HMGB1与EP的深入研究将为VILI的发病机制及治疗提供新的方向。

参考文献

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[7]Ulloa L, Ochani M, Yang H, et al.Ethylpyruvate prevents lethality in mice with establishedlethalsepsis and systemic inflammation[J]. ProcNatlAcadSci US A, 2002, 99(19):12351-12356.

Study on the Expression of High Mobility Group Box-1 Protein in Rat Model of Ventilator-Induced Lung Injury

MAJiefeiHEYizhouLUOZheTUGuoweiDepartmentofCriticalCareMedicine,Zhongshanhospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To investigate the expression of high mobility group box-1 (HMGB1) in rat model of ventilator-induced lung injury (VILI). Methods: Twenty-four healthy adult SD rats were randomly divided into three groups, with 8 rats in each group.The control group: autonomous respiration.The large tidal volume group: tidal volume(TV)=30 mL/kg.The ethyl pyruvate(EP) intervention group:EP 100 mg/kg via the caudal vein and the same ventilation mode as the large tidal volume group.The levels of HMGB1 and inflammatory factors in serum and bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and lung tissues, as well as in the culture medium of alveolar macrophages before and after mechanical stretching, were detected with Western blot-ting, RT-PCR and ELISA. Results: The levels of HMGB1 in serum, BALF and lung tissues of the large tidal volume group were higher than those of the control group. HMGB1 in the culture medium of alveolar macrophages was increased under mechanical stretching.The expression of HMGB1 decreased, and the proteins related to signal pathway of apoptosis as Caspase3, Caspase9 and PARP increased,in lung tissues of rat with VILI after EP intervention. Conclusions: The expression of HMGB1 increases in rat model of VILI, which may be related with the effect of mechanical stretching on alveolar macrophages. EP intervention had certain protective effect on lung tissues with VILI.

Key WordsVentilator-induced lung injury；High mobility group box-1 protein；Ethyl pyruvate

通讯作者屠国伟，E-mail: tu.guowei@zs-hospital.sh.cn

中图分类号R363.15

文献标识码A