性别和年龄对慢性丙型肝炎患者外周血中干扰素诱导基因表达的影响

牛志立　张平安　童永清

(武汉大学人民医院检验科，湖北武汉　430060)



·论著·

性别和年龄对慢性丙型肝炎患者外周血中干扰素诱导基因表达的影响

牛志立张平安童永清

(武汉大学人民医院检验科，湖北武汉430060)

摘要目的： 观察不同性别、年龄的慢性丙型病毒性肝炎(chronic hepatitis C，CHC)患者外周血单个核细胞(PBMC)中IFIT1(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1)和IFIT3的mRNA表达水平及意义。方法：选择CHC患者215例以及健康人79名，取全血。采用实时荧光定量PCR法检测PBMC中IFIT1和IFIT3基因的mRNA表达；应用全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)；用荧光探针检测HCV-RNA。结果：CHC患者PBMC中IFIT1和IFIT3的表达量与健康人群比较，差异均有统计学意义(t分别为22.35、22.75；P<0.05)。CHC患者的ALT、AST与健康人比较，差异均有统计学意义(t分别为34.38、21.38；P<0.05)。对CHC患者PBMC中的IFIT1、IFIT3基因表达量与年龄、性别、肝功能、LgHCV-RNA载量进行相关性分析发现，IFIT1、IFIT3基因的mRNA表达量与年龄(r分别为 0.395、0.482；P<0.05)和性别(r分别为0.453、0.358；P<0.05)呈正相关。结论：CHC患者PBMC中IFIT1、IFIT3基因的表达与性别和年龄相关。

关键词慢性丙型肝炎;外周血单个核细胞;干扰素诱导基因

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)属于黄病毒科，是单链正链RNA病毒。HCV宿主限于人类和黑猩猩，可引起人类丙型病毒性肝炎(丙型肝炎)。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3%[1]。最近有报告[2]认为，女性比男性更易感染急性丙型肝炎，但是，男性丙型肝炎患者更易发展为肝纤维化、肝硬化和肝癌。有研究[3]表明，女性HCV感染者具有更强的病毒清除能力和持续病毒学应答(sustained virologic response，SVR)，但具体机制尚不清楚。本研究旨在探讨不同性别和年龄的慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)患者的外周血单个核细胞(PBMC)中干扰素诱导基因(interferon stimulated gene，ISG) IFIT1(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1)和IFIT3的表达量及机体对HCV清除能力有否差异。

1资料与方法

1.1一般资料选择2013年3月—2014年8月在武汉大学人民医院感染科就诊的尚未接受治疗的CHC患者215例，其中中老年患者100例，青年患者115例。中老年患者中，女性51例，男性49例；年龄48～72岁，平均(64±5)岁。青年患者中女性58例，男性57例；年龄24～43岁，平均(33±7)岁。215例患者的诊断符合《丙型肝炎防治指南》[4]；排除自身免疫系统疾病、其他系统性严重疾病及感染性疾病。对照组为同期来我院进行体检的79名健康人，其中女性37名，男性42名；年龄31～74岁，平均(46±8)岁。本研究经我院伦理委员会批准[编号：(2013)鄂伦字(KY-035)]，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2主要试剂与仪器淋巴细胞分离液由天津美德太平洋科技有限公司提供，Trizol和SYBR Premix Ex Taq II由宝生物工程(大连)有限公司提供，反转录试剂盒由赛默飞世尔科技(中国)有限公司提供。PCR分析仪、VII7荧光定量分析仪由美国应用生物系统公司生产。

1.3研究方法

1.3.1引物设计引物由上海因维基生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1　引物序列

1.3.2mRNA的提取和逆转录采集所有研究对象的空腹静脉血2 mL，置于EDTA抗凝的采血管中，按照淋巴细胞分裂液说明书(天津美德太平洋科技有限公司)提取单个核细胞。采用Trizol法提取总mRNA。取11 μL RNA模板进行逆转录，加入 1 μL oligo引物混匀并瞬时离心(65℃， 5 min)，根据说明书配好反应体系，反应条件：42℃ 60 min，72℃ 10 min，4℃保存。得到的cDNA产物保存于-20℃备用。

1.3.3荧光定量PCR检测取cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，根据说明书配置反应体系，总体积为20 μL。IFIT1、IFIT3、GAPDH的扩增条件均为：94℃ 30 s预变性，94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 35 s，50个循环。溶解曲线条件：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。计算2-ΔΔCt，比较CHC组和健康组3个基因(IFIT1、IFIT3、GAPDH)mRNA的表达量。对3个基因的cDNA进行10倍稀释，稀释5个梯度，验证扩增效率，结果显示，目的基因和内参基因扩增效率相差小于5%，且均为98%~102%，可以认为两者扩增效率近似相等。

1.3.4HCV-RNA含量的测定据试剂盒的操作说明，采用荧光定量PCR检测HCV-RNA并计算LgHCV-RNA载量(以10为底数的HCV-RNA含量的对数)。HCV-RNA最低检测限为1×103拷贝/mL。

1.3.5肝功能指标检测应用德国Siemens ADVIA 2400型全自动生化仪及配套试剂测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。

2结果

2.1CHC患者和健康人群PBMC中IFIT1、IFIT3基因mRNA表达水平的比较以及肝功能指标的比较CHC患者PBMC中的IFIT1、IFIT3mRNA表达量比健康人群低4.32倍、4.05倍，差异有统计学意义(t分别为22.35、22.75，P<0.05)。CHC患者的ALT和AST与健康人群比较，差异均有统计学意义(t分别为34.38、21.38，P<0.05)，LgHCV-RNA载量均值为4.71拷贝/mL。见表2～3。

表2　CHC患者和健康人群PBMC中

注：ΔΔCt=[Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)]健康组-[Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)]CHC组

表3CHC患者和健康人群的肝功能指标比较

(U/L)

注：LgHCV-RNA载量表示以10为底的HCV-RNA载量；-表示阴性；*表示不进行统计学分析

2.2CHC患者PBMC中IFIT1和IFIT3基因的mRNA表达水平与年龄、性别、肝功能、LgHCV-RNA载量的相关性分析CHC患者PBMC中，IFIT1和IFIT3基因的mRNA表达量与年龄(rIFIT1=0.395，rIFIT3=0.482；P<0.05)和性别(rIFIT1=0.453，rIFIT3=0.358，P<0.05)呈正相关，而与ALT、AST和LgHCV-RNA载量(rIFIT1分别为0.142、-0.138、-0.097；rIFIT3分别为0.148、-0.153、0.046；P<0.05)均无相关性，见表4～5。

表4　CHC患者PBMC中IFIT1基因的mRNA表达水平

注：LgHCV-RNA载量表示以10为底的HCV载量的对数

表5　CHC患者PBMC中IFIT3基因的mRNA表达水平

注：LgHCV-RNA载量表示以10为底的HCV载量的对数

2.3CHC患者PBMC中IFIT1和IFIT3基因的mRNA表达量水平与年龄、性别的Logistics线性回归分析Logistics线性回归分析结果显示，CHC患者的年龄每增加1岁，IFIT1基因的mRNA阈值(Ct值)相应地增加0.132个循环(t=4.736，P<0.05)，IFIT3基因的mRNA Ct值则相应增加 0.190 个循环(t=5.629，P<0.05)。男性CHC患者IFIT1基因的mRNA Ct值比女性CHC患者高4.234个循环(t=5.344,P<0.05)，而前者IFIT3基因的mRNA Ct值比后者高4.144个循环(t=4.336,P<0.05)。IFIT1基因mRNA表达量与年龄、性别的回归方程为：y=3.74+0.132×年龄+4.234×性别，且该方程对IFIT1基因mRNA表达量有38.7%的解释程度。IFIT3基因mRNA表达量与年龄、性别的回归方程为：y=1.936+0.190×年龄+4.144×性别，且该方程对IFIT3基因mRNA表达量有38.5%的解释程度。见表6～7。

表6　CHC患者PBMC中IFIT1基因mRNA表达量

表7　CHC患者PBMC中IFIT3基因mRNA表达量

3讨论

有研究[5-6]报道，不同性别人群对HCV的免疫反应及抗病毒治疗的效果不同。HCV感染的女性病毒自我清除能力强于HCV感染的男性。在HCV感染的女性群体中，年轻女性的持续病毒学应答比老年女性更高，但是青年男性和老年男性之间并无此差异。对HCV感染的老年人群的研究发现，经过抗病毒治疗的老年男性要比经过抗病毒治疗的老年女性更易获得持久的病毒学应答反应，但是都不及绝经前的女性[7]。

IFIT家族基因属于干扰素诱导基因(interferon stimulated gene，ISG)，参与多种抗病毒免疫应答。其中IFIT1和IFIT3通过与真核起始因子3 (eukaryotic initiation factor 3，eIF3)相互作用而参与非特异性抗病毒应答，可抑制细胞和病毒中超过60%的蛋白质合成[8]，尤其能够限制HBV-DNA和HCV-RNA病毒的复制[9-10]。通过RNA干扰敲除IFIT1基因可使HCV病毒的复制增加[10]。病毒RNA携带的5′PPP-RNA被IFIT1识别后，可激活一系列的IFIT家族蛋白复合物，从而发挥抗病毒效应[11]。

本研究发现，CHC患者PBMC中IFIT1和IFIT3基因mRNA表达水平低于健康人群，这可能是HCV阻碍了ISG或细胞因子的表达而导致HCV慢性持续感染的原因[11]。有研究[12-14]表明，不同性别人群抗HCV感染能力的不同可能归因于性激素水平的不同；雌激素具有增强免疫的作用，而雄激素具有抑制免疫的作用。另有研究[15]表明，随着年龄的增加，激素水平下降，从而影响机体的免疫力。激素受体与雌激素反应元件结合可激活下游的核因子-kB(NF-kB)因子，而I型干扰素的激活需要NF-kB的参与[16]，这暗示雌激素对I型干扰素的表达具有促进作用。I型干扰素(IFN-α，IFN-β)通过激活JAK-STAT信号通路而激活干扰素诱导基因(IFIT1和IFIT3)，从而发挥抗病毒作用[16]。本实验对年龄、性别与Ⅰ型干扰素的相关性进行了分析，结果发现，年龄和性别可影响IFIT1和IFIT3基因的mRNA表达水平；且随着年龄的增加，IFIT1和IFIT3 mRNA的相对表达量降低，这可能是老年人易感染HCV并且易进展为肝硬化、肝癌的一个原因。男性PBMC中IFIT1和IFIT3的mRNA相对表达量低于女性，这有助于解释不同性别人群抗HCV能力的差异。

本研究还发现，CHC患者的肝功能指标ALT、AST、HCV-RNA载量与IFIT1和IFIT3基因表达量无相关性，其具体机制尚待进一步研究。

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Effects of Gender and Age on the Expression of Interferon Stimulated Gene in the Peripheral Blood of Patients with Chronic Hepatitis C

NIUZhiliZHANGPing′anTONGYongqingDepartmentofLaboratoryScience,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China

AbstractObjective： To investigate the mRNA expression of interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 (IFIT1) and IFIT3 in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in patients with chronic hepatitis C(CHC) with different genders and ages. Methods： Anticoagulant whole blood was collected from 215 patients with CHC and 79 healthy individuals. The mRNA expression levels of IFIT1 and IFIT3 were detected by real-time quantitative PCR. Alanine aminotransferase(ALT) and aspartate aminotransferase(AST) were detected by automatic biochemical analyzer. HCV-RNA was detected with fluorescent probe. Results： Expression levels of IFIT1 and IFIT3 in PBMC of patients with CHC were significantly different from those in healthy people (t=22.35,P<0.05;t=22.75,P<0.05). There were statistically significant differences in ALT and AST between patients with CHC and healthy people (t=34.38,P<0.05;t=21.38,P<0.05). The correlation analysis of gene expression levels of IFIT1 and IFIT3 in PBMC with age， gender， liver function and HCV load in CHC patients revealed that the mRNA expression levels of IFIT1 and IFIT3 were positively correlated with age (r=0.395,P<0.05;r=0.482,P<0.05) and gender(r=0.453,P<0.05;r=0.358,P<0.05). Conclusions： The expressions of IFIT1 and IFIT3 in PBMC are correlated with gender and age in CHC patients.

Key WordsChronic hepatitis C;Peripheral blood mononuclear cells;Interferon stimulated gene

中图分类号R512.6+3

文献标识码A