氧化苦参碱联合顺铂对SKOV3人卵巢癌细胞的作用

王东晖 刘丹彤 高洁凡 王晓红 史春燕

氧化苦参碱联合顺铂对SKOV3人卵巢癌细胞的作用

王东晖 刘丹彤 高洁凡 王晓红 史春燕

目的 探讨氧化苦参碱联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响。方法 MTT法检测氧化苦参碱2.5 mg/ml、5.0 mg/ml、10.0 mg/ml三个剂量联合顺铂3 μg/ml对细胞增殖的影响;流式细胞术检测氧化苦参碱联合顺铂对SKOV3细胞周期及凋亡率的影响;Western blot法检测Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 。结果 与顺铂组相比，氧化苦参碱3个剂量均能不同程度抑制SKOV3细胞增殖，5.0 mg/ml、10.0 mg/ml 2个剂量与顺铂组比较，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，抑制率与氧化苦参碱浓度正相关。氧化苦参碱能增强顺铂对细胞周期的影响作用，与顺铂组比较G0/G1期细胞显著增多(P＜0.05或P＜0.01);同时，氧化苦参碱联合顺铂组较顺铂组细胞凋亡率有所升高，10.0 mg/ml剂量组与顺铂组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。氧化苦参碱3个剂量均能不同程度下调Bcl-2蛋白表达，5.0 mg/ml、10.0 mg/ml 2个剂量与顺铂组比较，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);氧化苦参碱3个剂量均能不同程度上调Bax蛋白表达调，10.0 mg/ml剂量组与顺铂组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 氧化苦参碱具有增强顺铂对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用，并对细胞凋亡有促进作用，下调Bcl-4、上调Bax蛋白表达为其促凋亡机制之一。

卵巢癌;氧化苦参碱;顺铂;细胞凋亡

卵巢癌是严重威胁女性生命的恶性肿瘤，目前临场常用治疗手段主要是手术和化疗，而铂类是卵巢癌化疗方案中最常用的药物，但是肿瘤细胞对铂类的耐药性及其毒副作用往往导致化疗方案难以顺利实施。因此，寻找对化疗药物具有减毒或增效作用的辅助用药非常必要。氧化苦参碱是从豆科植物苦参中提取分离的一种生物碱，它的抗肿瘤活性受到了广泛关注并进行了大量的机制研究［1，2］。本课题通过分析氧化苦参碱与顺铂联合用药的卵巢癌细胞的影响，为其临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 卵巢癌SKOV3细胞，购于吉妮欧生物科技公司。氧化苦参碱注射液购于正大天晴制药公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)为Sigma公司产品。Annexinv-FITC/PI凋亡检测试剂盒，购于上海碧云天生物技术研究所。Bcl-2、Bax一抗购于Abcam美国公司。Epics XL流式细胞仪，Beckman Coulter公司。SpectraMax M2酶标分析仪，Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:将卵巢癌SKOV3细胞用含10%胎牛血清的1640培养基，在37℃、5%CO2培养箱内无菌培养。细胞融合80%左右时，0.25%胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 细胞分组:将SKOV3细胞分为空白对照组(A)、顺铂组(B)、顺铂与氧化苦参碱联用三个剂量组(C、D、E)，顺铂终浓度为 3 μg/ml，氧化苦参碱三个浓度分别为 2.5 mg/ml、5.0 mg/ml、10.0 mg/ml，每组 10个复孔。

1.2.3 MTT法检测氧化苦参碱对顺铂处理SKOV3细胞增殖的影响［3］:取对数生长期细胞，胰酶消化，台盼蓝计数，调整细胞浓度为5×106个/ml，每孔加细胞悬液 200 μl，置 37℃、5%CO2培养箱培养 24 h 后，分别加入相应药物，空白对照组加入等量培养基。加药48 h后，加入MTT 20 μl(浓度为2 g/L)，置培养箱中继续培养，时间为4 h，甩弃细胞培养基，每孔加入200 μl DMSO(二甲基亚砜)，置震荡器上震荡1 min，使蓝色晶体完全溶解后，用酶标仪于570 nm处检测吸光度(OD值)，并计算抑制率:抑制率=(空白对照组OD值-用药OD值)/空白对照组OD值×100%。

1.2.4 流式细胞术检测氧化苦参碱对顺铂处理SKOV3细胞周期的影响［4］:取对数生长期细胞，胰酶消化，台盼蓝计数，调整细胞浓度为5×106个/ml，按5 ml/瓶移至无菌培养瓶中，每组6瓶，培养24 h后加药，空白对照组加入等量培养基。加药后继续培养48 h。胰酶消化，收集细胞，PBS清洗2遍，然后用70%乙醇溶液于4℃冰箱进行固定，时长2 h，PI避光染色30 min后，300目尼龙网过滤，流式细胞仪进行检测，以cxp Analysis软件分析细胞周期及凋亡率。

1.2.5 Western blot法检测氧化苦参碱对顺铂处理SKOV3细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响:细胞常规培养，加药作用48 h后，胰酶消化，收集细胞，将细胞裂解后收集蛋白，考马斯亮蓝法进行蛋白定量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h。将封闭后的硝酸纤维素膜置入TTBS稀释(1∶500)的一抗溶液/β-actin(1∶1 000)稀释液，4℃缓慢摇动过夜。洗膜后，将膜置入适量以TTBS 1∶10 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中，于室温反应2 h。洗膜后抗体结合区带用化学发光法检测。将胶片扫描，Labworks软件下对条带进行吸光度积分扫描，以β-actin作为内参照，用目的蛋白灰度值/β-actin内参照胶片灰度值的比值为蛋白的相对表达量，进行统计分析。

2 结果

2.1 氧化苦参碱联合顺铂对SKOV3细胞增殖的影响MTT比色法显示，氧化苦参碱与顺铂联合应用能够抑制SKOV3细胞增殖，且能增强顺铂的抑制作用，其中氧化苦参碱5.0 mg/ml、10.0 mg/ml 2个剂量组与顺铂组比较，差异有统计学意义(P＜0.05或0.01)。见表1。

表1 氧化苦参碱联合顺铂对SKOV3细胞增殖的影响n=10，±s

表1 氧化苦参碱联合顺铂对SKOV3细胞增殖的影响n=10，±s

注:与A组比较，*P ＜0.01;与B组比较，#P ＜0.05，△P ＜0.01

组别 OD值 抑制率(%)A组0.833±0.062 0 B组 0.657±0.041* 21.13 C组 0.621±0.053* 25.45 D组 0.608±0.044*# 27.01 E组 0.579±0.057＊△30.49

2.2 氧化苦参碱对顺铂处理SKOV3细胞周期的影响与空白对照组比较，各用药组G0/G1期细胞均增多(P＜0.01)，且氧化苦参碱3个剂量均能增强顺铂的作用(P＜0.05或P＜0.01);与空白对照组比较，S、G2/M期细胞均减少，其中G2/M期细胞减少尤为明显(P ＜0.01)，氧化苦参碱 5.0 mg/ml、10.0 mg/ml组与顺铂组相比明显降低(P＜0.05或P＜0.01);与空白对照组比较，各用药组SKOV3细胞均显著升高(P＜0.01)，而氧化苦参碱10.0 mg/ml组较顺铂组升高尤为明显(P＜0.05)。见表2。

表2 氧化苦参碱对顺铂处理SKOV3细胞周期的影响n=6，%，±s

表2 氧化苦参碱对顺铂处理SKOV3细胞周期的影响n=6，%，±s

注:与A组比较，*P ＜0.01;与B组比较，#P ＜0.05，△P ＜0.01

组别 G0/G1 S G2/M 凋亡率A组 47.28±5.73 39.72±4.65 13.01±1.96 3.21±0.54 B组 56.49±3.92* 36.03±4.02 7.48±1.21* 28.26±5.73*C组 63.72±6.05＊△ 30.97±4.11* 5.31±1.41*# 30.82±6.16*D组 65.14±5.22＊△ 29.72±3.69*# 5.14±1.33＊△ 34.73±5.92*E组 68.28±7.03*# 26.97±4.26＊△ 4.75±1.11＊△ 38.28±6.74*#

2.3 氧化苦参碱对顺铂处理SKOV3细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 与空白对照组比较，各用药组Bcl-2蛋白表达均显著下调(P ＜0.05或P ＜0.01)，而Bax蛋白表达均显著上调(P＜0.05或P＜0.01);与顺铂组比较，氧化苦参碱5.0 mg/ml、10.0 mg/ml组 Bcl-2蛋白表达显著下调(P＜0.05或P＜0.01)，氧化苦参碱10.0 mg/ml组Bax蛋白表达显著上调(P＜0.05)。见表3。

表3 氧化苦参碱对顺铂处理SKOV3细胞Bcl-2、Bax相对蛋白表达量的影响n=3，±s

表3 氧化苦参碱对顺铂处理SKOV3细胞Bcl-2、Bax相对蛋白表达量的影响n=3，±s

注:与A组比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01;与B组比较，△P ＜0.05，☆P ＜0.01

组别Bcl-2 Bax A组0.67±0.03 0.36±0.04 B组 0.55±0.04* 0.48±0.05*C组 0.52±0.03# 0.53±0.05#D组 0.43±0.04#△ 0.58±0.06#E组 0.40±0.03#☆ 0.61±0.04#△

3 讨论

MTT法常用于大规模抗肿瘤药物的筛选、肿瘤细胞放化疗敏感性测定等，灵敏度高，经济。它的结果反映的是存活细胞的数量，但另一个方面，它又反映了药物对肿瘤细胞增殖、凋亡、死亡的综合效应。结果显示，顺铂有效抑制了卵巢癌SKOV3细胞的生长，氧化苦参碱联合用药组对肿瘤细胞的抑制作用更为明显，效果优于单用顺铂组，且存在明显的剂量依赖关系。

细胞凋亡(apoptosis)是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，是机体清除衰老、损伤、突变细胞的重要方式。目前，很多学者认为细胞凋亡受抑是肿瘤发生的重要原因，而诱导细胞凋亡已经成为肿瘤治疗的新靶标。迄今为止，国内外众多科研人员借助分子生物学技术，就细胞凋亡做了大量的探索工作，提出了很多观点和假说，但是仍然没有找到有关细胞凋亡过程的确切机制［5，6］。有研究表明，细胞凋亡和细胞周期有相关性，细胞周期阻滞于哪一期，凋亡就发生在哪一期［7，8］。细胞周期分为间期和分裂期两个阶段，细胞大部分生命活动时间是在间期度过的。间期又分为DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。细胞增殖周期能否顺利进行，主要取决于G1/S转换盒G2/M转换，这是调控细胞周期进程的2个节点。本研究结果表明，顺铂能过将卵巢癌SKOV3细胞阻滞于G0/G1期，使得进入S期的细胞比例有所降低。氧化苦参碱能够增强顺铂对卵巢癌SKOV3细胞的阻滞作用，并且随浓度增高，G0/G1期细胞比例逐渐升高，S期细胞比例显著降低，故我们推测，细胞凋亡主要发生在G1期。凋亡的发生过程受到多种基因的调控，目前研究较多的有p53、caspase、Bcl-2等。Bcl-2是抗细胞凋亡蛋白的代表，Bax是促细胞凋亡的代表，两者相互拮抗，二者平衡时细胞正常生长［9］。随着氧化苦参碱浓度的上升，Bcl-2蛋白表达逐渐降低，而Bax蛋白表达明显升高，细胞凋亡率也随之升高，故我们推测氧化苦参碱诱导的SKOV3细胞凋亡与Bcl-2、Bax蛋白表达失衡有关。

顺铂作为卵巢癌常用化疗药物，肿瘤细胞产生的耐药性以及药物本身的毒副反应为临床应用造成了一定障碍，本研究对氧化苦参碱用于卵巢癌化疗辅助用药有一定的参考价值，但仍然存在缺陷，如只观察了药物对卵巢癌SKOV3一个时间点作用效果，未进行动态观察来评价药物作用与时间的关系，程度如何;顺铂只设一个剂量组，未进行氧化苦参碱能否降低顺铂IC50值的相关研究等，这些我们将在后续研究中进行完善。另外，氧化苦参碱对耐药卵巢癌细胞株的作用、对其他卵巢癌细胞株的作用等一系列研究等待我们开展。我们将通过大量的研究工作来观察氧化苦参碱能否在不影响疗效的前提下降低化疗药物用量，增强化疗效果，或增加肿瘤对化疗药物的敏感性。

1 周喜汉，韦星，黄赞松，等.苦参碱对结肠癌sw1116细胞增殖及端粒酶活性的影响.中药材，2009，32:923-925.

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3 司徒镇强，吴军正主编.细胞培养.第1版.西安:世界图书出版公司，1996.186-187.

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5 Fan TJ，Han LH，Cong RS，et al.Caspase family protease and apoptosis.Acta Biochim Biophys Sin，2005，37:719-727.

6 Yamashita S，Masuda Y，Kurizaki T，et al.Survivin expression predicts early recurrence in early-stage breast cancer.Anticancer Res，2007，27:2803-2808.

7 姜浩，樊光华.人参皂甙-Rh2对人肝癌Bel-7404细胞增殖和凋亡的影响.中国肿瘤临床与康复，2004，11:289-292.

8 Basu A，Haldar S.The relationship between Bcl2，Bax and p53:consequences for cell cycle progression and cell death.Mol Hum Report，1998，4:1099-1109.

9 Cory S，Huang DC，Adams JM.The Bcl2 family:roles in cell survival and oncogenesis.Oncogene，2003，22:8590-8607.

R 737.31

A

1002-7386(2015)23-3556-03

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．011

061001 河北省沧州市中心医院(王东晖、刘丹彤、高洁凡、史春燕);河北省泊头市妇幼保健医院(王晓红)

2015-06-10)