慢性阻塞性肺疾病大鼠肺表面活性蛋白A表达的变化

索丹

慢性阻塞性肺疾病大鼠肺表面活性蛋白A表达的变化

索丹

目的以烟熏慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠的肺组织为标本, 检测肺表面活性蛋白A(SPS-A)在COPD病程中的变化。方法选取健康雄性七周龄Wistar大鼠25只, 体重180～220 g, 随机分为对照组(5只)与COPD组(20只)。采用烟熏法制备COPD大鼠模型, 按照COPD病程的时间分为4组, 每组5只, 分别为COPD 1 d组(A组)、COPD 1月组(B组)、COPD 2月组(C组)、COPD 3月组(D组)。采用免疫组织化学法, 检测表面活性蛋白A在各组大鼠肺组织中的表达。结果该法建立COPD大鼠模型的肺组织病理学改变基本符合人类COPD组织病理学改变特点。免疫组化显示COPD组的A、B、C、D组 SP-A检测结果(OD值), 与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01), COPD组中D组SP-A检测结果(OD值)较A、B、C组有所回升, 差异有统计学意义(P＜0.05)。结论SP-A在烟熏COPD大鼠肺组织中的表达比正常对照组明显减少, 与肺气肿的严重程度成负相关。COPD大鼠肺组织中SP-A明显减少可能是COPD发生发展的重要因素之一。

慢性阻塞性肺疾病；肺表面活性蛋白A；烟熏

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是世界上发病率和死亡率的重要原因之一。肺表面活性物质(PS)是一种脂质与特异蛋白结合而成的脂蛋白复合物 , 主要由肺泡II型上皮细胞合成,能降低肺泡的液-气界面表面张力 , 以防止肺泡在低肺容量时塌陷 , 对维持肺的正常功能至关重要。SP-A主要在肺泡Ⅱ型上皮细胞中表达[1], 是肺表面活性物质的重要成分之一, 本实验观察了烟熏所致肺气肿模型肺组织中SP-A表达变化 , 并与肺组织病理学改变进行对比研究 , 以探讨其在COPD中的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性7周龄Wistar大鼠25只, 体重180～220 g(由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供)。

1.1.2 实验试剂 兔抗SP-A购自武汉博士德公司, 免疫组化SABC试剂盒和DAB显色试剂盒均为武汉博士德公司产品, Poly-Lysine防脱片剂购自武汉博士德公司

1.1.3 实验仪器及设备 冰箱；图像分析软件： NIS-Elements BR2.0型 日本尼康公司；显微镜：ECLIPSE E800型日本尼康公司；冰冻切片机 LEICA CM 1900 德国。

1.2 实验方法

1.2.1 采用烟熏法制备COPD大鼠模型。根据文献介绍[2]：烟熏70 d大鼠可以形成COPD模型, 因此以烟熏70 d为准,进行取材。25只大鼠随机分为对照组(5只)与COPD组(20只), 按照COPD病程的时间分为4组, 每组5只, , 分别为COPD1 d组(A组)；COPD1月组(B组)；COPD2月组(C组)；COPD 3月组(D组)。分别在形成COPD后1 d、1、2、3个月取材。

1.2.2 标本制备 氯胺酮(100 mg/kg)腹腔内注射麻醉大鼠。显露气管, 开胸。取右肺全肺, 于10%甲醛固定, 常规脱水、石蜡包埋, 4 um厚度连续切片3张, 用于免疫组化检测。

1.2.3 免疫组化法测定SP-A的表达 免疫组化染色法参照试剂盒说明书进行, 载玻片选择Poly-Lysine防脱片剂处理。SP-A以胞浆棕黄色为阳性。采用NIS-Elements BR2.0型图象分析仪测定SP-A阳性细胞的光密度( OD值)。

1.3 统计学方法 应用SPSS11.5统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

对照组与COPD组肺泡Ⅱ 型上皮细胞 , 细支气管上皮均可见SP-A表达。对照组未检到阳性表达；COPD组中 A、B、C组OD值较对照组明显减少(P＜0.01)；D组OD值增加, 分别由(0.1505±0.0005)降至(0.1385±0.0108)、(0.1311±0.0011)、(0.1257±0.0490)、(0.1431±0.0005)。COPD组OD值明显低于对照组, 差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1 大鼠肺脏SPA检测结果(±s)

表1 大鼠肺脏SPA检测结果(±s)

注：与对照组比较,aP＜0.01； 与A、B、C组比较,bP＜0.05

组别 动物数(只) OD 值对照组 5 0.1505±0.0005 COPD组A组 5 0.1385±0.0108aB组 5 0.1311±0.0011aC组 5 0.1257±0.0490aD组 5 0.1431±0.0005ab

3 讨论

COPD是一种具有气流受限特征的可以预防和治疗的疾病, 气流受限不完全可逆, 呈进行性发展, 与肺部对香烟、烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。PS是由脂质和蛋白质组成的复合物, 其中90%是磷脂, 以二棕榈酰卵磷脂和磷脂酰甘油为主, 后两者是降低肺泡表面张力的主要活性成分。8%～10%是与脂质特异性结合的蛋白质, 称之为肺表面活性物质相关蛋白(SPs)。SPs是70 年代末才被认识的一类蛋白质, 目前已发现的SPs 包括亲水性的SP-A、SP-D 和疏水性的SP-B、SP-C。其中, SP-A 和SP-D 都是糖结合蛋白, 属于胶凝素家族成员, 主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞和Clara 细胞合成和分泌。SP-A 和SP-D是先天免疫系统的成员[3]。SP-A 是最先被发现且在肺泡Ⅱ型上皮细胞中表达最强烈、信号最丰富的蛋白。SP-A可以帮助形成具有高度表面活性的管状髓鞘结构, 调节表面活性物质磷脂的循环和分泌, 协助表面活性物质磷脂降低肺泡表面张力, 增强肺泡巨噬细胞的吞噬和杀伤能力。

本实验发现SP-A在烟熏COPD大鼠肺组织中的表达比正常对照组明显减少, 且COPD形成后1 d～2个月SP-A的表达逐渐减少。肺气肿3个月后SP-A的表达有所增加, 提示随着肺泡重建, Ⅱ型肺泡上皮细胞的合成增多, 其功能亦有恢复, 合成SP-A增多。

综上所述, SP-A的减少可以促进COPD的发生发展。对于SP-A的检测提示COPD大鼠肺组织中SP-A明显减少可能是肺气肿发展的重要因素之一。本实验发现应用于临床,作为COPD的诊断及病情观察, 以及外源性SP-A应用于临床治疗COPD有待进一步研究。

[1]叶燕青, 李清泉, 程真顺, 等. 不同因素致急性肺损伤大鼠的病理转归及肺泡表面活性蛋白-A的动态变化. 中华结核和呼吸杂志, 2009, 32(12):950-952.

[2]Spragg RG, Smith RM. Pathology of the surfactant system of the mature lung. Am J Respir Crit Care Med, 1997, 155(2):756-760.

[3]常绍鸿. 支气管哮喘患者血清SP-A和IL-5测定及其相关性研究. 医学信息, 2012, 25(6):163.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.18.213

2015-04-13]

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