PRKAG2心脏综合征中R302Q突变对心肌细胞糖原和钙离子稳态的影响

张亚平　颜彦　宋振举　童朝阳

(复旦大学附属中山医院急诊科，*心内科，上海　200032)



·论著·

PRKAG2心脏综合征中R302Q突变对心肌细胞糖原和钙离子稳态的影响

张亚平颜彦*宋振举童朝阳

(复旦大学附属中山医院急诊科，*心内科，上海200032)

摘要目的：探讨PRKAG2心脏综合征中R302Q突变对心肌细胞糖原和钙离子稳态的影响。方法： 用表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)、PRKAG2-WT、PRKAG2-R302Q的腺病毒感染大鼠H9C2心肌细胞，同时设正常对照组。感染24 h和48 h后，采用过碘酸-雪夫(Periodic acid-Schiff，PAS)染色法进行糖原染色，观察心肌细胞的糖原贮积；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞内糖原含量；同时用Rohd-2/AM活体染料进行钙离子染色，然后采用流式细胞术分析钙离子库信号差异。结果：EGFP组与对照组糖原染色和含量结果无明显差别；PRKAG2-WT组糖原染色和含量略微增强；PRKAG2-R302Q组糖原染色和含量明显增强。各组的钙离子稳态并未受到影响。结论：PRKAG2心脏综合征中R302Q突变导致心肌细胞内糖原贮积，而钙离子稳态并未受到影响，没有钙超载现象发生。

关键词PRKAG2心脏综合征；R302Q突变；糖原；钙超载

PRKAG2心脏综合征是一种常染色体显性遗传病，由PRKAG2基因突变造成[1]。PRKAG2基因编码腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)的γ2调节亚基[2]。PRKAG2综合征临床表现为进行性心肌细胞糖原贮积、心肌肥厚、室性预激和传导系统疾病[3-4]，甚至可能会发展成致命的室性心律失常，患者随时有发生心脏性猝死的危险。PRKAG2心脏综合征患者通常在30岁前发病，有传导阻滞的患者更易发生心脏性猝死，相当一部分患者需要安装永久起搏器。由于该病有心肌肥厚的表现，故患者常常被误诊为肥厚性心肌病。我们的前期研究[5]报告1例具有心肌肥厚和预激表型的PRKAG2综合征患者；克隆PRKAG2基因并测序显示，该患者带有1个杂合的R302Q突变，PRKAG2基因B3切(剪切方式)，306位碱基G被A取代，302位精氨酸被谷氨酰胺取代，导致R302Q突变。2001年，Gollob等[6]首次报告PRKAG2综合征的基因测序分析结果，证实患者都存在PRKAG2-R302Q突变，但在中国人群中未有报道。PRKAG2心脏综合征的最典型的特点为心肌细胞糖原贮积，但关于R302Q突变对心肌代谢状况的影响目前并无深入研究。因此，本研究在细胞水平上探究了PRKAG2心脏综合征患者中R302Q突变对糖原贮积以及钙离子稳态的影响。

1资料与方法

1.1材料DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)，优级胎牛血清(美国Hyclon公司)，H9C2大鼠胚胎心肌细胞株(中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)，钙离子荧光探针Rohd-2/AM(日本同仁化学研究所)； 过碘酸-雪夫(Periodic acid-Schiff，PAS)糖原染色试剂盒(美国Sigma公司)。

1.2重组腺病毒的制备和感染应用AdEasyTM系统(美国Stratagene公司)包装目的重组腺病毒，具体步骤参见说明书。本研究分别选择表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)、PRKAG2-WT、PRKAG2-R302Q的腺病毒，同时设正常对照组。将H9C2心肌细胞种在12孔板各孔中的玻璃盖玻片上，24 h后分为4组，每组6个孔。各组分别加入5~10 μL相应的重组腺病毒。分别于感染24 h和48 h后进行糖原染色、糖原含量检测、钙离子染色分析等。

1.3糖原染色糖原染色采用PAS染色法，光镜下观察心肌细胞的糖原贮积状况。PAS阳性反应表现为细胞质内有紫红色球状颗粒。

1.4糖原含量的检测采用糖原检测试剂盒(ELISA法)，严格根据试剂盒要求，检测细胞内糖原含量。

1.5钙离子染色大鼠 H9C2心肌细胞感染表达EGFP、PRKAG2-WT、PRKAG2-R302Q的腺病毒48 h后，在培养皿中加入Rohd-2/AM染料进行钙离子染色。再经过磷酸盐缓冲液漂洗，消化成单细胞后采用流式细胞术进行钙离子库信号差异分析。

2结果

2.1糖原染色感染重组腺病毒后24 h和48 h的PAS染色结果相似。EGFP组与对照组糖原染色结果无明显差别；PRKAG2-WT组糖原染色略微增强；PRKAG2- R302Q组糖原染色明显增强；见图1。

2.2糖原含量的检测采用ELISA法检测各组心肌细胞内糖原含量，结果显示，EGFP组在24 h和48 h与正常对照组无差异(P>0.05)；PRKAG2-WT组细胞内糖原含量较正常对照组稍高，但是差异无统计学意义(P>0.05),而PRKAG2 - R302Q组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

A：正常对照组；B：EGFP组；C：PRKAG2-WT组；D：PRKAG2-R302Q组

组别24h糖原含量P值48h糖原含量P值正常对照组0.2763±0.0021-0.2446±0.0020-EGFP组0.2520±0.00180.32970.2379±0.00170.3391PRKAG2-WT组0.2789±0.00160.51230.2502±0.00200.5165PRKAG2-R302Q组0.3667±0.0022*0.00690.2830±0.0030*0.0256

注：与正常对照组比较，*P<0.05为差异有统计学意义

2.3钙离子染色通过钙离子染色、流式细胞术分析大鼠H9C2心肌细胞钙离子库的信号差异，结果发现，EGFP组、PRKAG2-WT组、PRKAG2-R302Q组以及对照组的钙离子稳态均未受到影响。

3讨论

由于PRKAG2心脏综合征患者心肌肥厚的表现与肥厚型心肌病极其相似，故临床中极易将前者误诊为后者而耽误治疗。在携带PRKAG2突变基因的患者中，常存在心律失常，随着心肌肥厚逐渐进展，易出现左心功能不全及心脏肥大[7-8]。然而，与编码肌小节蛋白的基因突变引起的典型肥厚性心肌病相比较，PRKAG2突变患者经组织病理学检查发现心肌纤维排列紊乱者罕见，心肌间质纤维化程度也很低[7]。这表明PRKAG2突变导致心肌肥厚的发病机制可能与肥厚性心肌病并不相同。国外对于PRKAG2基因相关突变的基础研究[9]认为，突变引起腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性改变。AMPK是由α、β和γ 3个亚基组成的异源三聚体蛋白。其中，α亚基是AMPK的催化亚基，β和γ亚基是AMPK的调节亚基。AMPK激活后，通过增强葡萄糖摄取和脂肪酸氧化，促进葡萄糖转运和糖酵解，维持细胞内能量代谢平衡。故AMPK活性增加会引起糖原异常贮积。有研究[9]在2005年发现，PRKAG2基因突变N488I可引起AMPK活性增加，引起心肌细胞糖原的异常贮积，该结论同时在T400N转基因鼠的动物模型中得到证实。Gollob等[10]发现，PRKAG2基因突变R302Q引起AMPK活性降低，也引起心肌细胞大量糖原贮积及心肌肥厚表现；推测是否因先前AMPK活性增强引起糖原贮积，其后由于心肌肥厚后的负反馈导致AMPK活性降低。本研究亦发现R302Q突变导致心肌细胞糖原的大量贮积，其机制有待进一步研究。

钙离子升高是心肌肥厚信号转导发生、发展的中心环节。当心肌细胞受到机械牵张或心脏负荷增加时，心肌细胞内钙离子浓度出现反应性增加。心肌细胞内钙离子的升高可激活细胞内一系列依赖钙离子的ATP酶，使ATP降解增加。这不仅使肌球蛋白和肌动蛋白脱耦联受到抑制，而且使肌浆网和细胞质膜的钙离子转运受损，进一步使细胞质内钙离子浓度升高。以此形成恶性循环，导致钙离子超载。钙离子超载可启动钙离子介导的信号转导途径，从而参与心肌肥厚的发生和发展。本研究从细胞水平证实，PRKAG2基因的R302Q突变对心肌细胞钙离子库没有显著影响，但存在AMPK活性紊乱引起的糖原贮积，具体机制有待进一步研究。

参考文献

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Effect of R302Q Mutation on Glycogen and Calcium Ion Homeostasis of Cardiomyocytes in PRKAG2 Cardiac Syndrome

ZHANGYapingYANYan*SONGZhenjuTONGChaoyangDepartmentofEmergency,*DepartmentofCardiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To investigate the effect of R302Q mutation on glycogen and calcium ion homeostasis of cardiomyocytes in PRKAG2 cardiac syndrome. Methods:The rat H9C2 cardiomyocytes were infected with adenovirus containing enhanced green fluorescent protein(EGFP), PRKAG2-WT, and PRKAG2-R302Q,meanwhile, normal control group was set up.After 24 h and 48 h,Periodic acid-Schiff(PAS) staining was used to observe cardiomyocyte glycogen storage, and the glycogen content in cells was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Meanwhile, Rohd-2/AM vital dye was used to carry out calcium ion staining,and then the signal differences among calcium stores were analyzed by flow cytometry. Results: There was no obvious difference regarding glycogen staining and content between EGFP group and control group. Glycogen staining and content was slightly enhanced in PRKAG2-WT group, while glycogen staining and content was obviously enhanced in PRKAG2-R302Q group.However, the calcium ion homeostasis in each group was not affected. Conclusions: R302Q mutation leads to intra cardiomyocyte glycogen accumulation in PRKAG2 cardiac syndrome. However, calcium ion homeostasis is not affected and there is no calcium overload.

Key WordsPRKAG2 cardiac syndrome；R302Q mutation；Glycogen；Calcium overload

通讯作者童朝阳，E-mail: tong.chaoyang@zs-hospital.sh.cn

基金项目：复旦大学附属中山医院青年基金项目(编号：QNJJ2012-09)

中图分类号R 541

文献标识码A