丁苯酞氯化钠注射液对大鼠延髓缺血后微血管密度丙二醛、超氧化物歧化酶的影响

朱 江，窦志杰，丁 萌，张玉坤，张 杰，高兰英

脑组织慢性低灌注状态可造成缺血缺氧，产生大量自由基攻击线粒体，线粒体结构受损功能亦发生相应改变，出现呼吸链的电子传递链发生障碍、ATP 合成下降、能量代谢障碍、葡萄糖利用减少、蛋白质合成异常、血管内皮细胞缺失、神经元坏死和凋亡［1］。目前认为脑组织缺血后自由基增多是脑损伤加重的主要原因［2］，而超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等是反映氧自由基水平的主要指标。

本实验通过观察丁苯酞氯化钠注射液对大鼠延髓缺血后微血管密度、SOD、MDA 水平的影响，探讨丁苯酞氯化钠注射液清除自由基的有关机制及对延髓缺血后的保护作用。

1 材料和方法

1.1 动物与分组 SPF 级Wistar 成年健康雄性大鼠，220～260 g，购于河北医科大学实验动物中心。60 只大鼠随机分为3 组:假手术组、治疗组、缺血对照组。其中假手术组每组6 只大鼠，其余按时间点分为7 d、14 d 两个亚组，每组12 只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 延髓缺血模型制备 结扎右侧颈总动脉，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，仰卧固定，颈部正中切口，钝性分离胸锁乳突肌，暴露分离出右侧颈总动脉并结扎切断，检查无活动性出血后，用生理盐水和青霉素(1 ×105U/L)冲洗后缝合伤口。电凝椎动脉:大鼠俯卧固定，于后正中线第一颈椎水平处作纵形切口，沿中线分开肌层，暴露第一颈椎横突孔，将高频电刀的电凝刀头插入横突孔内凝闭椎动脉3～4 s，检查无活动性出血后，用生理盐水和青霉素(1 ×105U/L)冲洗后缝合伤口。待清醒后，单笼保温喂养。

1.2.2 实验动物的干预方法 假手术组只暴露双侧椎动脉及右侧颈总动脉，不做血管阻断处理。治疗组、缺血对照组均在阻断双侧椎动脉及右侧颈总动脉后立即开始治疗。治疗组每天腹腔注射丁苯酞氯化钠注射液两次，时间间隔12 h，每次注射计量按3 mg/kg 计算，到术后7 d 和14 d 两个时间点分别处死，取延髓。缺血对照组每天腹腔注射生理盐水两次，时间间隔12 h，每次注射计量为0.5 ml/次。到术后7 d 和14 d 两个时间点分别处死，取延髓。

1.2.3 实验标本制作 将大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，麻醉后快速断头法处死，在冰盘上快速取延髓，置于0 ℃～4 ℃生理盐水中漂洗，清除血液，滤纸拭干。每个亚组中6 只脑组织用于单宁酸-氯化铁媒染法观察微血管密度，另外6 只脑组织放入9 倍量的0 ℃～4 ℃生理盐水中，在冰水浴中用玻璃匀浆器制成10%脑匀浆，用离心机3500 r/min，离心15 min，取上清液分3 份置于-20 ℃保存，用于测定SOD、MDA 含量。

1.2.4 观察指标 (1)脑组织中SOD、MDA 含量测定。延髓中SOD、MDA 含量:SOD 含量采用黄嘌呤氧化酶法测定。MDA 含量采用硫代巴比妥酸TBA)比色法测定。(2)单宁酸-氯化铁媒染法观察微血管密度:每只大鼠取3 张切片，采用Simple PCI-8 图像分析软件分析脑组织微血管灰度。每张切片在光镜下选5 个视野，取平均灰度值进行统计学分析。该分析仪器的灰度级为0～256 灰级，平均灰度表示阳性细胞的反应强度，平均灰级越高，说明反应强度越低。

1.2.5 统计学方法 所得数据采用统计学软件SPSS 14.0 进行分析，采用t 检验，以均数±标准差()表示，P ＜0.05 有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织大体变化 延髓缺血后水肿于7 d明显，14 d 时有所减轻。治疗组各时间段脑组织肿胀程度与缺血对照组相比均减轻。

2.2 各组脑组织中SOD、MDA 含量比较 与假手术组相比，治疗组、缺血对照组SOD 均减少;治疗组与缺血对照组相比较，治疗组SOD 含量升高。缺血对照组MDA 含量较高;治疗组的MDA 含量较缺血对照组减低(见表1、表2)。

2.3 各组脑组织中微血管灰度的变化 通过对7 d、14 d 后实验动物的观察，治疗组及缺血对照组的微血管灰度值较假手术组均增加。治疗组数值增加的幅度低于缺血对照组。其中，治疗组微血管灰度值在各时段均低于缺血对照组。与假手术组相比较二者均有统计学差异(见表3)。

表1 各组大鼠脑组织中SOD 含量的比较(，n=6)

表1 各组大鼠脑组织中SOD 含量的比较(，n=6)

与假手术组相比#P ＜0.05;与缺血对照组相比* P ＜0.01

表2 各组大鼠脑组织中MDA 含量的比较(，n=6)

表2 各组大鼠脑组织中MDA 含量的比较(，n=6)

假手术组相比#P ＜0.05;与缺血对照组相比* P ＜0.01

表3 各组大鼠脑组织中微血管灰度值比较(，n=6)

表3 各组大鼠脑组织中微血管灰度值比较(，n=6)

与假手术组相比#P ＜0.05;与缺血对照组相比* P ＜0.01

3 讨论

脑组织缺血后出现细胞水肿、兴奋性氨基酸产生增加、Ca2+内流增加。细胞水肿线直接导致脑组织的占位效应，更为严重的是大量自由基级联反应，产生大量活性氧，活性氧与包括神经元、微血管细胞在内的神经元单元各种细胞成分发生反应蛋白质破坏、细胞膜降解［3～5］。在正常情况下机体内氧自由基含量很少，其中内源性自由基清除剂发挥重要作用［6］。SOD 作为内源性氧自由基清除剂，是一种金属蛋白酶，可保护生物体免受自由基的影响［7］。SOD 含量在一定程度上间接反映内源性氧自由基清除能力。MDA 是膜脂质降解产生的代谢产物，用来反映脂质过氧化的指标，其含量的变化间接反应组织中氧自由基含量的变化［8］。丁苯酞氯化钠注射液可保护缺血脑组织和改善脑能量代谢，抑制自由基的产生［9～11］，抑制Ca2+超载，抑制脂质过氧化反应，也能防止氧化性细胞损伤，减少缺血半暗带面积，可减轻血管内皮细胞损害［12，13］。

通过本实验结果可见，缺血7 d 延髓水肿程度显著升高。丁苯酞氯化钠注射液治疗组延髓组织水肿程度较缺血对照组明显降低。丁苯酞氯化钠注射液可能通过抑制氧自由基生成，有效控制细胞通透性变化，减轻缺血造成的延髓组织水肿。治疗组SOD水平7 d 明显高于缺血对照组，各时间点MDA 水平均明显低于缺血对照组。说明丁苯酞氯化钠注射液在延髓缺血过程中通过清除自由基，减轻了脑组织损伤。SOD 水平在延髓缺血7 d 时明显高于缺血对照组，而在延髓缺血14 d 时出现下降，提示丁苯酞氯化钠注射液对自由基的清除效果于缺血7 d 时明显，之后药物作用减弱。本研究发现，与假手术组相比较，治疗组微血管灰度值增加的程度明显低于缺血对照组。因丁苯酞氯化钠注射液减轻自由基对内源性SOD 的消耗，同时有效地减轻血管内皮细胞的损伤，微血管密度增加可从根本途径上改善脑组织缺血造成的损伤。但随着延髓缺血时间的延长，自由基产生的增加，SOD 在数量上会减少，提示在治疗上应尽早用药干预。

本实验结果提示，延髓缺血后由于自由基产生，使缺血脑组织损伤加重，丁苯酞氯化钠注射液通过清除自由基，减轻血管内皮细胞损害，发挥了对神经细胞的保护作用。

［1］高钟生，郭宗成，张和振，等.丁苯酞注射液对慢性脑低灌注状态大鼠前脑线粒体超微结构及ATP 酶活性的影响［J］.脑与神经疾病杂志，2008，20(4):420-422.

［2］姜德华，金男革，玄汉石，等.大鼠急性局灶性脑缺血，再灌注脑组织NO 含量和NOS 活性的变化［J］.临床神经病学杂志，2000，13:201-203.

［3］Grech ED，Dodd NJ，Jackson MJ，et al.Direct detection of free radical generation after primary percutaneous transluminal coronary angioplasty recanalizationg in acute myocardial infarction［J］.Am J Cardiol，1996，77(2):122-127.

［4］杨生龙.高血压脑出血急诊抢救150 例分析［J］.当代医学，2011，17(36):98-99.

［5］徐悦，孙洪涛，马铁柱，等.依达拉奉治疗急性重型颅脑创伤的临床研究［J］.中风与神经疾病杂志，2007，24(3)337-339.

［6］Hallevy C，Ifergane G，Kordysh E，et al.Spontaneous supratentorial intracerebral hemorrhage criteria for short-term functional outcome prediction［J］.Neuroscience，2002，249(12):1704-1709.

［7］赵连东，晋光荣，徐汉荣，等.丁苯酞氯化钠注射液对缺血再灌注大鼠脑组织及血清超氧化物歧化酶、一氧化氮、丙二醛的影响［J］.临床神经病学杂志，2006，19(1):60-62.

［8］Gloviczky P，Stanson AW，Stickler GB，et al.Klippel-Trenaunay syndrome:the risks and benefits of vastcular interventions［J］.Survery，1991，110(3):469-479.

［9］Shimon A，Tstsushi K.Expression of anti-apoptotic and neuroprotective effects of edura vone following transient focal ischemia in rats［J］.Eur J Pharmacol，2005，516(2):125-130.

［10］GEY KF，Stahelin HB，Eichholzer M.Poor plasm a status of carotene and disease and stroke basel propective study［J］.Clin Invesl，1993，71(1):385-389.

［11］Wolvetang EJ，Johnson KL，Krauer K，et al.Mitochondrial respiratory chain inhibitors induce apoptosis［J］.FEBS Lett，2002，339(2):40-44.

［12］郑献召，张三军，石头莉，等.丁苯酞治疗大鼠脑缺血再灌注损伤作用机制的研究［J］.中国实用神经疾病杂志，2009，12(23):59-61.

［13］秦延昆，谢海洋.丁苯酞氯化钠注射液联合降纤酶治疗急性脑梗死的疗效观察［J］.临床神经病学杂志，2005，18:218.