肢体远隔缺血适应对大鼠缺血再灌注后脑水肿的影响

宋海庆，李 宁，张安波，任长虹

脑血管病以其高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率及逐年递增的防治费用成为危害人民健康最为严重的疾病之一，目前急性期最有效的临床治疗为动、静脉溶栓，通过及时实现缺血区域的血液再灌注，可能从根本上阻止神经系统发生不可逆损伤。但其严格的时间窗和出血风险导致仅有不到3%的患者接受溶栓治疗［1］。作为一种机体内源性对抗缺血损伤的保护策略，缺血适应为缺血性脑血管病的治疗提供了一条新的思路［2］。远隔缺血期适应(remote ischemic perconditioning)是指在缺血敏感的重要靶器官发生缺血事件后，通过对相对耐受缺血的远隔器官给予多次短暂的缺血/再灌注处理产生的保护作用。2014 年来自丹麦的研究小组进行了随机对照临床实验［3］，在患者出现脑卒中后，在送往医院的救护车上给患者实施肢体缺血远隔适应(limb remote ischemic conditioning，LRIC)。研究结果显示，与对照组比较，肢体缺血适应能够降低脑组织梗死的风险。近年LRIC 对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用已得到共识，然而目前，对于肢体缺血适应降低脑水肿的作用及其机制尚不十分清楚。而缺血后持续的脑水肿是导致死亡率增加的重要因素之一。脑缺血再灌注后脑水肿的发生主要为血脑屏障(BBB)破坏导致的血管源性水肿(vasogenic edema)、细胞毒性水肿(cytotoxic edema)以及渗透性水肿(osmotic edema)［4］。MMP-9 参与了脑缺血急性期血-脑屏障的破坏，导致血管源性脑水肿和脑出血［5］，TIMP-1 能够抑制MMP-9 的表达［6］。水通道蛋白Aquaporins(AQP)为跨膜分布的四聚体蛋白，调控细胞内外水分子的转运，参与脑缺血后血管源性及细胞毒性水肿。13 个家族成员中AQP-4 与AQP-9 与缺血后脑水肿密切相关。本研究利用大鼠MCAO 模型，探讨LRIC 对缺血/再灌注后脑水肿的影响，同时探讨LRIC 对MMP-9 及水通道蛋白AQP-4、AQP-9 表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试药及实验器材 恩氟烷(河北九派制药)，水合氯醛(化学纯，北京化工厂)，TTC (Sigma公司)，伊文思蓝(Evans Blue，EB)(Sigma 公司)，甲酰胺分析纯(天津市德兰精细化工厂，分析纯)，BCA 蛋白定量试剂盒(Thermo 公司)，抗MMP-9 抗体(Santa Cruze 公司)，抗AQP-9、AQP-4 抗体(Santa Cruze 公司)，HRP 标记的二抗(中杉金桥公司)。

1.2 实验动物与分组 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(280-300 g)，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，SCXK(京)2007-0001。将动物随机分为3 组:大脑中动脉结扎(middle cerebral artery occlusion，MCAO)(对照组)、MCAO+LRIC (治疗组)及假手术组(Sham)。

1.3 局灶脑缺血/再灌注MCAO 模型 大鼠1%～2%恩氟烷混合30% O2和70%N2O 维持麻醉，大鼠右侧MCAO 模型采用Zea longa 线栓法制备，术中肛温维持在(37 ±2)℃。小心分离右侧颈总动脉，将线拴由颈外动脉残端插入颈内动脉，沿颈内动脉向斜上方将线栓插入至有抵触感时停止插栓。栓塞1.5 h 后拔除线栓制备缺血/再灌注损伤模型。模型制作后随机分为对照组与治疗组。缺血10 min 后给予肢体缺血适应(8 mm 宽止血带扎紧大鼠栓侧下肢近心端，10 min 缺血，再灌注10 min，共3 个循环)。再灌注48 h 后取材进行后续研究。

1.4 血脑屏障通透性测定 大鼠再灌注后46 h经尾静脉注射伊文思蓝(2%，4 ml/kg)，使其在体内循环2 h 后麻醉，经左心室进针插入到主动脉弓灌注生理盐水200～250 ml，分别取大脑左右半球称重，加入2 ml 甲酰胺匀浆，54 ℃温育2 h 后离心(12，000 g，15 min)。采用分光光度计测光密度值(620 nm)，以EB 标准曲线浓度计算脑组织中EB的含量，用mg/g 表示。

1.5 脑组织含水量测定 取大脑左右半球分别称重，在120 ℃烤箱烘烤12 h。测大脑干湿重比(湿重-干重/湿重)×100 %。

1.6 脑梗死面积的测定 大鼠脑缺血1.5 h/再灌注48 h 后处死大鼠(治疗与对照组各7 只大鼠)，在视交叉处向后切取厚度为2 mm 的冠状切片，缺血区周边右侧脑组织用于蛋白印迹分析。TTC 染色:将脑片置于1% TTC 染液(溶解在PBS溶液中)，37 ℃避光染色10 min。扫描仪扫描，使用Image-Pro-Plus(version 5.1)图像分析软件计算脑梗死面积，梗死面积百分率=(梗死区脑组织面积)/正常侧大脑半球体积×100%。

1.7 神经功能检测 神经功能评分采用两种方法:前爪放置实验及Longa 评分法。前爪放置实验，用手遮住大鼠双眼，手托大鼠将前爪置于桌子边缘，用手轻触大鼠鼻子侧的胡须，每侧碰触10 次，结果记做:(大鼠前爪抓桌沿的次数/10)× 100%。Longa 评分法:无神经功能损伤，记0 分;不能完全伸展左前爪，记1 分;行走时向左侧转圈，记3 分;不能自发行走且意识丧失，记4 分;死亡记5 分。

1.8 蛋白印迹分析(Western blot) 取右侧剩余脑组织缺血周边区，放入液氮中速冻，放入-80 ℃冰箱中冻存。加入3 倍体积(质量/体积)的RIPA 裂解缓冲液［50 mmol Tris (pH7.5)，1%Triton X-100，150 mmol NaCl，0.1% SDS，1% sodium deoxycholate］，研磨及超声裂解提取总蛋白。采用BCA 法测蛋白浓度。80 μg 蛋白在12.5%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，分离后转移至PVDF 膜(Millipore Corporation，USA)。用5%脱脂奶粉在室温封闭膜1 h，分别加入一抗:抗MMP-9 的多克隆抗体(1 ∶500);TIMP-1 单克隆抗体(1∶ 2000)、AQP-9 多克隆抗体(1 ∶ 500)、AQP-4 多 克 隆 抗 体(1 ∶ 500)，Phosphoglyceraldehyde Dehydrogenase(GAPDH)单克隆抗体(1∶ 2000)、4 ℃孵育过夜，HRP 标记的二抗室温孵育1 h，用化学发光试剂盒显色。

2 结果

2.1 LRIC 能够减轻缺血再灌注损伤后脑组织含水量 缺血/再灌注48 h 后取脑测定脑组织含水量，与对照组相比，LRIC 治疗组缺血侧脑组织含水量明显低于对照组(P ＜0.05)(见表1)。

2.2 LRIC 能够改善缺血再灌注损伤后BBB的通透性 缺血/再灌注48 h 后，通过检测脑组织中EB 的含量，检测BBB 的通透性。两组之间在缺血对侧的EB 含量没有显著差异(P ＞0.05)(见表2)。与对照组相比，LRIC 治疗组缺血侧EB 含量显著降低(P ＜0.05)，说明LRIC 能够改善缺血再灌注损伤后BBB 的通透性。

2.3 LRIC 能够改善大鼠脑梗死面积 缺血1.5 h，再灌注48 h 后取脑进行TTC 染色，结果显示LRIC 治疗组的脑梗死面积明显低于对照组(P ＜0.01)(见表3)。

2.4 LRIC 能够改善缺血再灌注损伤后神经功能 缺血/再灌注后立即进行Longa 神经功能评分及前爪放置实验，治疗组与对照组之间没有显著差异(见表4)，说明模型的神经功能损伤基本一致。再灌注48 h 后Longa 神经功能评分结果显示两组之间没有显著差异。然而前爪放置实验显示，治疗组的神经功能评分明显低于对照组(P ＜0.05)(见表4)。

2.5 LRIC 能够降低MMP-9 蛋白表达 缺血/再灌注48 h 后取缺血侧脑组织梗死周边区，Western blot 结果显示:LRIC 组的MMP-9 蛋白表达明显低于对照组(P ＜0.05)(见图1)。然而两组之间TIMP-1蛋白表达没有显著性差异(P ＞0.05)(见图2)。

2.6 LRIC 对水通道蛋白AQP-9、AQP-4 的表达没有影响 因为水通道蛋白与脑缺血后脑水肿具有相关性，因此我们进一步检测了AQP-4、AQP-9 的表达，结果显示LRIC 对AQP-4、AQP-9 的蛋白表达均没有影响(P ＞0.05)(见图3)。

表1 各组脑组织含水量比较(%，)

表1 各组脑组织含水量比较(%，)

与对照组比较* ＜0.05

表2 各组脑组织EB 含量比较(mg/g，)

表2 各组脑组织EB 含量比较(mg/g，)

与对照组比较* P ＜0.05

表3 各组脑梗死面积比较(%，)

表3 各组脑梗死面积比较(%，)

与对照组比较* P ＜0.05

表4 各组神经功能评分比较(SE)

图1 治疗组与对照组MMP-9 蛋白表达。(A):MMP-9 表达的Western blot 代表图片;(B):MMP-9 光密度分析结果＊＊P ＜0.01

图2 治疗组与对照组TIMP-1 蛋白表达。(A):TIMP-1 表达的Western blot 代表图片;(B):TIMP-1 光密度分析结果

图3 治疗组与对照组AQP-9、AQP-4 蛋白表达。(A):AQP-9、AQP-4 表达的Western blot 代表图片;(B):AQP-9、AQP-4 光密度分析结果

3 讨论

近年，远隔缺血期适应对缺血性脑损伤的神经保护研究日益增多，然而其对缺血/再灌注损伤后脑水肿的影响及可能的机制尚未见报道。本研究结果显示在大鼠缺血后给予LRIC 治疗，治疗组脑含水量、血脑屏障通透性、脑梗死体积、神经功能缺损程度均比对照组明显降低。说明LRIC 可能通过减轻血脑屏障损伤从而减低脑水肿发挥神经保护作用。

脑缺血再灌注后脑水肿的发生主要为BBB 破坏导致的血管源性水肿、细胞毒性水肿以及渗透性水肿［4］。BBB 是分隔血液与大脑的复杂的屏障系统，在脑缺血后，血管内皮损伤，细胞外基质破坏从而导致BBB 完整性破坏，进而引起血管源性脑水肿。MMP-9 作为锌离子依赖的肽链内切酶，能够酶切多种细胞外基质成分。MMP-9 主要表达在周细胞与内皮细胞，调控血-脑屏障的完整性。在正常生理状态下MMP-9 蛋白表达量较低，脑缺血/再灌注损伤后，表达量异常增加。缺血性脑卒中后MMP-9 高表达，并释放入细胞间基质，导致多种蛋白降解，从而加重血管损伤，引起BBB 的进一步破坏，最终导致血管源性脑水肿［7］。Maddahi 等报道，MMP 抑制剂能够减小脑梗死面积，并抑制脑水肿［8］。本研究在缺血后给予肢体缺血适应，再灌注48 h 后脑梗死周边区治疗组的MMP-9 蛋白表达量明显低于对照组，说明肢体缺血适应可能通过抑制MMP-9 的表达减轻缺血后BBB 的破坏，从而减轻脑水肿。TIMPs家族是20-29 kD 的分泌蛋白家族，其中TIMP-1 是内源性MMP-9 抑制剂［6］。研究表明，TIMP 保护神经细胞的凋亡和死亡，是通过影响MMP-9 调控的兴奋性氨基酸毒性而实现的［9］。为了检测LRIC 对TIMP-1 的影响，我们进一步检测了脑梗死周边区TIMP-1 的蛋白表达，结果显示LRIC 处理对TIMP-1蛋白表达变化没有影响。因此我们推测，LRIC 对MMP-9 的影响可能不是通过抑制TIMP-1 的表达，也可以间接说明LRIC 的神经保护作用可能是直接通过减轻BBB 的通透性实现的。然而我们还没有直接的证据证明以上假说，需要今后进一步深入研究。

在脑组织中，AQP-4 主要分布于星形胶质细胞的足突及血管内皮细胞，因此AQP-4 与血管具有密切相关性，血液中的水分子通过AQP-4 通道从血管腔进入星形胶质细胞，因此与缺血后脑水肿具有相关性［7］。通过对AQP-4 基因敲除小鼠的研究表明，AQP-4 参与了脑实质中细胞外液的清除［10］。Manley等人报道AQP-4 基因敲除小鼠脑缺血损伤后星形胶质细胞足突的肿胀现象及脑水肿明显低于野生型小鼠。预后也明显改善［11］。AQP-9 与AQP-4 有类似的功能，二者共同参与脑缺血后水分子的转运调节［12］。然而我们的研究结果表明LRIC 并没有影响脑缺血后AQP-4 及AQP-9 的表达，以上结果提示LRIC 减轻脑水肿并不是通过影响水通道蛋白的表达来实现的。以上研究结果也为我们今后的研究提出了问题;为什么LRIC 只调控了MMP-9 的表达，而没有影响水通道蛋白的表达，可能LRIC 对以上蛋白的调节具有时相性，也可能调控的细胞外信号通路不同，需要我们进一步深入研究，从而明确LRIC 神经保护的分子信号机制。

肢体远隔缺血适应以其操作简便易行、设备廉价的优势，在临床上具有广阔的应用前景。本研究为肢体缺血适应在急性脑血管病领域的临床应用奠定了实验基础。

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