晚发型Pompe 病患者的临床、病理及GAA 基因突变特点

赵丹华，才丽娜，杨 旭，李继来，杜继臣

Pompe 病，又称糖原累积病Ⅱ型(GSDⅡ)，是一种罕见的常染色体隐性遗传的溶酶体贮积病，为编码酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的基因突变导致溶酶体内糖原分解障碍并广泛沉积于全身所致［1］。根据发病年龄、受累器官及疾病进展情况，可将Pompe病患者分为婴儿型(infantile-onset Pompe disease，IOPD)及晚发型(late-onset Pompe disease，LOPD)两种。典型的IOPD 患者生后数月即发病，主要表现为心脏扩大、肌张力低下及呼吸窘迫，2 岁前死亡;而LOPD 患者1 岁后发病，又可分为儿童型、青少年型及成人型，主要表现为中轴肌及四肢骨骼肌无力，部分伴随骨骼及心脑血管病变［1～3］。目前临床上对LOPD 的认识不足，导致许多患者从就诊到确诊的时间长于5 y［4］。在此，我们对1 例LOPD 患者的临床表现、病理改变及分子遗传学基础进行了详细的研究。

1 材料和方法

1.1 临床资料 23 岁女性，主因“腹胀1 w，加重伴憋气3 d”就诊。患者于入院前1 w 无明显诱因出现腹胀、腹围增加，4 d 后加重，伴胸闷、憋气，不能平卧。外院查腹部B 超提示腹水(深度5.1 cm);心电图示:窦性心律，顺钟向转位，电轴右偏;超声心动示:右心增大(右房横径44 mm，右室横径37 mm)伴三尖瓣关闭不全，肺动脉高压(52 mm-Hg)，左室射血分数69%，少量心包积液;胸片示:双下肺纹理增粗、模糊，心影略饱满。临床诊断为肺动脉高压，右心功能不全，给予利尿等治疗，症状一度好转，后又加重。为求进一步诊治收入我院心内科。入院当日患者神志清楚，无明显憋气，自行步入病房。查血气分析示:pH 7.334，PaO233 mmHg，PaCO284 mmHg，SpO256%，提示Ⅱ型呼吸衰竭。予低流量吸氧、利尿及兴奋呼吸等治疗无效，患者PaCO2进行性升高，意识水平逐渐下降，复查血气分析示pH 7.029，PO248 mmHg，PCO2＞130 mmHg，SpO285%。遂立即给予气管插管，呼吸机辅助呼吸，0.5 h 后神志转清，复查血气分析恢复正常。此后患者病情稳定，复查超声心动示右心室大小及肺动脉压力均降至正常，腹部B 超未见腹水，且呼吸机参数逐渐下调至可脱机水平，但拔管撤机后患者很快出现明显的呼吸费力，指尖氧饱和度迅速下降至70%以下，故再次予气管插管，呼吸机辅助呼吸。此后患者始终维持压力支持通气模式(压力支持8 mmHg，吸入氧浓度30%)，多次尝试脱机均失败。

为明确病因，进一步追问病史，发现患者3 y 前出现双下肢活动后易疲劳症状，缓慢加重，但不影响生活及工作;6 m 前家人发现其睡眠中呼吸节律较慢，有张口呼吸及耸肩动作。患者父母非近亲结婚，家族史阴性。神经系统查体示四肢近端肌力4 级，远端5 级，四肢肌容积显著减少，体质指数(BMI)13.7 kg/m2。肌酶无异常。干血片法检测患者外周血GAA 酶活性为5.98 pmol/punch/hr(正常参考范围20～40 pmol/punch/hr)。

1.2 研究方法

1.2.1 骨骼肌病理检查 经知情同意，对患者行右股四头肌活体组织检查。肌肉标本进行常规组织学和酶组织化学染色，染色方法包括:苏木精-伊红(HE)、改良Gomori 染色、高碘酸Schiff 反应(PAS)、油红“O”脂肪染色、三磷酸腺苷酶、还原型辅酶I 四氮唑还原酶(NADH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素氧化酶(COX)、非特异性酯酶(NSE)染色。

1.2.2 基因检查 采集患者4 ml 静脉血并提取基因组DNA。PCR 反应扩增GAA 基因1～20 号外显子及其侧翼序列，PCR 产物送北京华大中生科技发展有限公司，用ABI3730XL 型DNA 全自动测序仪进行直接测序。所有PCR 产物均进行双向测序。对发现的新突变在100 例正常对照中进行筛查。

1.2.3 逆转录 用TRIzol 试剂一步法提取患者总RNA，在M-MLV 逆转录酶作用下反转录得到第一链cDNA。以cDNA 为模板进行PCR 反应，使用Primer 3 设计引物覆盖第9、10 号外显子全长及部分11 号外显子，(正向引物:5'CGTTCAACAAGGATGGCTTC 3’，反向引物5'GTGGGTTCTCCAGCTCATTG 3’)。应用琼脂糖凝胶检测PCR 产物并进行双向测序。

2 结果

骨骼肌主要病理改变为肌纤维内出现大量嗜碱性空泡，部分空泡内可见PAS 深染物质沉积(见图1)，未见脂肪滴成分，空泡肌纤维累及两型，以Ⅱ型肌纤维为主，部分肌纤维内出现NSE 深染物质沉积，上述病理改变提示GSDⅡ可能。

GAA 基因分析显示，患者第16 号外显子上存在c.2238G ＞C 突变，为已报道的致病性突变;第10 号内含子存在c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT缺失突变(见图2)，经逆转录PCR 证实该突变可以导致mRNA 上第10 号外显子丢失，其编码的38 个氨基酸(p.480-517)被跨越，产生截短蛋白(见图3)，进一步在100 例正常对照者中均未检测到该缺失突变。

图1 患者的骨骼肌病理结果

图2 患者GAA 基因测序分析

图3 患者逆转录PCR 产物凝胶电泳及测序分析

3 讨论

本例患者青年发病，主要表现为严重呼吸功能障碍及轻度四肢近端无力，外周血白细胞GAA 酶活性低于正常对照的30%，肌肉活检显示空泡性肌病，部分空泡内可见PAS 深染物质沉积，故诊断为LOPD。GAA 基因检测显示患者存在c.2238G ＞C及c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT 复合杂合突变，进一步从基因水平上确诊该病。结合其发病年龄，该患者属于成年型。

肢带型肌无力伴呼吸肌力弱是LOPD 患者最常见的临床表型［3］。本例患者在疾病早期即出现了呼吸衰竭，而肢体运动功能相对保留，提示其呼吸肌受累较四肢骨骼肌更严重。有研究表明，部分LOPD 患者以呼吸困难为首发症状，发病数年后才丧失行走能力，甚至有个别患者可以通过使用便携式呼吸机自己步行到医院复诊［4，5］。由此可见，LOPD 患者呼吸功能障碍突出。但是，也有部分患者首先出现肢体无力，坐轮椅10 余年后方才需要使用呼吸机。因此，LOPD 患者在呼吸肌和骨骼肌受累的顺序方面存在很大异质性，其呼吸肌功能与四肢肌力之间无相关性［4，6］。

Pompe 患者的呼吸功能障碍主要表现为限制型通气障碍，以吸气肌无力突出，尤其是膈肌［7］。膈肌力弱首先表现为卧位肺活量较立位明显下降，导致夜间低通气及高碳酸血症，继而出现睡眠呼吸障碍、清晨头痛及白天睡眠过多等不适。本例患者在就诊前有入睡后张口呼吸及耸肩等表现，提示当时已存在夜间呼吸困难，但未引起注意。随着疾病的进展，呼吸肌力逐渐下降，LOPD 患者白天肺活量亦下降，出现低氧血症、肺心病及呼吸衰竭［8～10］。本患者在就诊时亦存在明确的肺动脉高压、右心功能不全及呼吸衰竭表现，其临床特点符合该病的发展规律。虽然有文献报道LOPD 患者存在肺静脉闭塞病(PVOD)，是导致肺高血压的原因［11］，但本患者的肺动脉收缩压在纠正了低氧及高碳酸血症之后降至正常，故推测缺氧等可逆性因素在其肺高血压的形成过程中发挥了更大的作用。

脊柱强直综合征伴低体重是LOPD 患者另一种常见的临床表型［3］。本例患者仅有BMI 过低，而没有脊柱强直表现。LOPD 患者出现BMI 过低，推测可能与以下几种因素有关:疾病本身导致的吞咽困难、胃肠功能障碍、严重的肌肉萎缩及呼吸功能障碍。因为长期的呼吸功能不全会导致体内能量的过度消耗，继而引起BMI 明显下降，而给予酶替代治疗后，随着肌力的改善，患者BMI 指数亦增加［12］。但也有文献报道酶替代治疗不能改善LOPD 患者的BMI，并认为BMI 过低是其预后不良的指标之一［11］。

GAA 基因全长28kb，包含20 个外显子，共编码952 个氨基酸［2］。目前已报道该基因突变300 余种(www.pompecenter.nl)。本例患者存在c.2238G＞C 及c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT 复合杂合突变。其中，c.2238G ＞C 点突变为已报道的致病性突变，也是中国内地及中国台湾LOPD 患者的热点突变［2，13，14］;而c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT 缺失突变为新突变，该突变导致mRNA 上第10 号外显子缺失，其所编码的38 个氨基酸被跨越。由于p.470-517 位于该蛋白的催化结构域，其后连接活性中心D518，且N470 也是蛋白翻译后进行糖基化修饰的7 个位点之一［15］，因此推测10 号外显子缺失将对蛋白的结构和催化功能产生重要影响;同时，在100 例健康对照者均未发现相同突变，综合以上分析考虑该突变为致病性突变。而剪切突变导致的关键结构域的受损，也许是患者病情较重且迅速进展的原因之一。

［1］van der Ploeg AT，Reuser AJ.Pompe's disease［J］.Lancet，2008，372(9646):1342-1353.

［2］Wan L，Lee CC，Hsu CM，et al.Identification of eight novel mutations of the acid alpha-glucosidase gene causing the infantile or juvenile form of glycogen storage disease type Ⅱ［J］.J Neurol，2008，255(6):831-838.

［3］Schüller A，Wenninger S，Strigl-Pill N，et al.Toward deconstructing the phenotype of late-onset Pompe disease［J］.Am J Med Genet C Semin Med Genet，2012，160C(1):80-88.

［4］Hagemans ML，Winkel LP，Van Doorn PA，et al.Clinical manifestation and natural course of late-onset Pompe's disease in 54 Dutch patients［J］.Brain，2005，128:671-677.

［5］Van der Beek NA，Haqemans ML，Reuser AJ，et al.Rate of disease progression during long-term follow-up of patients with late-onset Pompe disease［J］.Neuromuscul Disord，2009，19(2):113-117.

［6］Mellies U，Ragette R，Schwake C，et al.Sleep-disordered breathing and respiratory failure in acid maltase deficiency［J］.Neurology，2001，57(7):1290-1295.

［7］金巍娜，阙呈立，唐海燕，等.晚发型糖原贮积病Ⅱ型患者呼吸功能临床研究［J］.中国现代神经疾病杂志，2014，14(5):399-404.

［8］Mellies U，Lofaso F.Pompe disease:a neuromuscular disease with respiratory muscle involvement［J］.Respir Med，2009，103(4):477-484.

［9］Shahrizaila N，Kinnear WJ，Wills AJ.Respiratory involvement in inherited primary muscle conditions［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2006，77(10):1108-1115.

［10］Mellies U，Stehling F，Dohna-Schwake C，et al.Respiratory failure in Pompe disease:treatment with noninvasive ventilation［J］.Neurology，2005，64(8):1465-1467.

［11］Kobayashi H，Shimada Y，Ikeqami M，et al.Prognostic factors for the late onset Pompe disease with enzyme replacement therapy:from our experience of 4 cases including an autopsy case［J］.Mol Genet Metab，2010，100(1):14-19.

［12］Ravaglia S，Danesino C，Moglia A，et al.Changes in nutritional status and body composition during enzyme replacement therapy in adult-onset type Ⅱglycogenosis［J］.Eur J Neurol，2010，17(7):957-962.

［13］Liu X，Wang Z，Jin W，et al.Clinical and GAA gene mutation analysis in mainland Chinese patients with late-onset Pompe disease:identifying c.2238G ＞C as the most common mutation［J］.BMC Med Genet，2014，15(1):141.

［14］Yang CC，Chien YH，Lee NC，et al.Rapid progressive course of later-onset Pompe disease in Chinese patients［J］.Mol Genet Metab，2011，104(3):284-288.

［15］Kroos M，Hoogeveen-Westerveld M，van der Ploeg A，et al.The genotype-phenotype correlation in Pompe disease［J］.Am J Med Genet C Semin Med Genet，2012，160(1):59-68.