响应面法优化S2菌株的培养条件*

刘江红，任静薇，贾云鹏，杨林峰，于 博，李 航

(1.东北石油大学 化学化工学院 石油与天然气化工省重点实验室,黑龙江 大庆 163318；2.大港油田 石油工程研究院,天津 300280；3.大庆 城市排水公司，黑龙江 大庆 163318；4.东北石油大学 数学与计算机学院,黑龙江 大庆 163318)

响应面法优化S2菌株的培养条件*

刘江红1†，任静薇1，贾云鹏2，杨林峰3，于 博1，李 航4

(1.东北石油大学 化学化工学院 石油与天然气化工省重点实验室,黑龙江 大庆 163318；2.大港油田 石油工程研究院,天津 300280；3.大庆 城市排水公司，黑龙江 大庆 163318；4.东北石油大学 数学与计算机学院,黑龙江 大庆 163318)

利用快速筛选方法从大庆采油三厂油田采出水中筛选出高产生物表面活性剂菌株S2，经鉴定为芽孢杆菌属.对S2菌株产生的生物表面活性剂进行提取及纯化后，通过离子鉴别实验及红外光谱法对其进行定性检测，确定其种类为非离子型脂肽类.以菌种S2产生的发酵液的乳化指数(E24)为指标，通过响应面优化方法对S2菌株的培养条件进行优化，以接种量、pH值、温度、摇床转速为因素优化对象进行实验.在此模型的基础上，通过二次回归方程得出最佳值是pH为7.2、温度为43.5 ℃ 、接种量为5.2%(V/V)、摇床转速为162 r/min.在优化后的最佳培养条件下，测得菌株S2所产生发酵液的最优E24为81.20%.

发酵液；红外光谱法；响应面实验；乳化；菌株

生物表面活性剂是微生物在一定条件下发酵产生且具有表面活性的次级代谢产物，其性质为同时具有亲油性和亲水性[1].生物表面活性剂对疏水性物质具有有效的乳化、润湿、分散、溶解作用，同时使体系的表/界面张力有所下降[2-3].自然界中存在许多微生物(细菌、真菌等)，这些微生物能够在发酵培养过程中分泌产生不同种类的生物表面活性剂.现在化学合成的表面活性剂因其造成环境污染而使其使用面临着巨大的环境压力，生物表面活性剂具有功能的多样性和对环境的友好性，且在食品工业、原油采出、污染环境的修复等领域中起着越来越重要的作用.

作为一种综合性优化方法，响应面优化法结合了数学方法和统计学方法，主要内容包括优化实验设计、响应曲面分析和拟合优化计算3部分，被广泛地应用在微生物培养条件优化和生化反应中[4].本实验通过Box-Behnken响应面设计的应用对生物表面活性剂高产量菌株S2的发酵培养条件进行优化，以乳化指数E24为响应值，pH值、温度、接种量及摇床转速为其主要影响因素，通过实验后得到的数据并分析各因素的最佳条件，从而提高乳化指数.通过对本实验模型的3D响应曲面图和等高线图的分析，可以直观地得出各因素与乳化指数E24的响应关系及各因素间交互作用的显著程度[5-6].采用Design-Expert 8.0.5软件进行实验设计、数据处理及模型建立.

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 主要设备

XZD-3型界面张力仪，上海平轩科学仪器有限公司；超声细胞破碎仪，赛飞(中国)有限公司；薄层色谱层析缸(100×100)，天津市思利达科技有限公司 ；红外光谱仪，大塚电子(苏州)有限公司.

1.1.2 菌株来源

以快速法为筛选方法，从大庆采油三厂的油田采出水中筛选出高产生物表面活性剂纯菌种S2，经实验室一系列生理、生化实验鉴定后，确定S2菌种为芽孢杆菌属(Bacillussp.).

1.1.3 培养基

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20 g，mNaNO3=0.5 g，mKH2PO4=1 g，mNa2HPO4=2 g，mMgSO4=0.02 g，mFeSO4=0.01 g，mNaCl=5 g，mCaCl2=0.08 g，pH值为7.2～7.4，121 ℃灭菌20 min.

1.2 实验方法

1.2.1 发酵液的乳化指数(E24)测定[7]

将经过72 h震荡培养后的发酵液用离心机去除菌体细胞，取其5 mL和5 mL液体石蜡混合于比色管中，在100 W的超声波中进行细胞粉碎处理，待形成白色乳化液后，静置24 h，测量E24的公式如式(1)所示.

(1)

1.2.2 发酵液的表面张力测定

采用Wihelmy板法对菌株的发酵液进行表面张力测定.移取发酵液10 mL置于直径为4 cm的培养皿中，发酵液的表面张力被表面张力测定仪测定，在每次测定前，需将铂片用蒸馏水冲洗干净，并用酒精灯对铂片进行灼烧.以蒸馏水做空白实验.

1.2.3 生物表面活性剂提取、纯化

本实验采用酸沉淀法进行表面活性剂纯化.将S2菌株发酵液在10 000 r/min的转速下离心20 min后取其上清，上清液用浓盐酸(2 mol/L)调节至pH为2.0，在温度为4 ℃静置过夜.静置后的溶液在相同转速下继续离心20 min，弃其上清，用少量蒸馏水重悬沉淀，用浓NaOH调节至pH为7.0，样品于-20 ℃放置5 h后，在真空条件下冷冻干燥24 h.所得的样品即为该生物表面活性剂的粗品，将其称重后用无水甲醇进行超声溶解，在14 000 r/min的转速下离心10 min后，取其上清并在46 ℃下进行旋转蒸发.

1.2.4 生物表面活性剂的定性鉴别实验

通过亚甲基蓝-氯仿法、酸性溴酚蓝法及浊点法对提纯后的生物表面活性剂进行离子鉴别实验.

用KBr压片法把经过甲醇萃取得到的生物表面活性剂纯品压片，利用红外吸收光谱对其进行测定.红外吸收光谱上出现吸收峰对应的波长范围可用来判断其相应的官能团，进而确定该样品的分子结构.

1.2.5 响应面实验设计

根据Box-Behnken实验设计原理，进行4因素3水平(分别以-1，0，+1编码)的响应面分析实验，各因素的实验水平及编码如表1所示.29组实验对应的29个实验点可以分为析因点和零点，为了更好地估算实验中可能存在的误差，需要重复进行5次零点实验.

Box-Behnken优化实验中具体的实验点设置如表2所示.通过实验数据的二次回归拟合分析得到各因素与响应值间的回归方程，分析各因素与响应值间的主效应、因素间的交互效应得到最佳响应值.

表1 Box-Behnken实验因素水平及编码

表2 Box-Behnken实验点设计及实验结果

2 结果与讨论

2.1 生物表面活性剂的定性鉴别实验

2.1.1 生物表面活性剂的离子鉴别实验

观察实验现象为阴离子鉴别实验中氯仿层显无色，阳离子鉴别实验中溶液不变色，非离子鉴别实验中溶液内有新相生成.通过上述实验结果可知S2菌株所产生物表面活性剂种类为非离子型.

2.1.2 红外光谱分析

由图1分析可知，生物表面活性剂在3 300 cm-1～3 200 cm-1有一个较宽的吸收峰，其分子具有键C-H和N-H的伸缩振动，表示该物质是含有氨基的碳氢化合物并且存在分子内氢键.此外在2 927 cm-1,2 896 cm-1和2 358 cm-1处有3个较强吸收峰，表示该物质含有C-CH3键或是含有长烷基.在6 654 cm-1处拥有最强吸收峰，表示该生物表面活性剂分子含有肽键，分子内的C=O键伸缩振动引起与此处相邻的1 532 cm-1的另一强吸收.由红外谱图可知，S2菌株发酵产生的生物表面活性剂具有与脂肽类基本一致的特征吸收峰.

波数/cm-1

2.2 实验结果与模型分析

应用Design Expert软件对表2的实验数据进行二次多元回归拟合，分析后得到4个因素与乳化指数E24之间的二次拟合回归方程(A：pH值，B：温度，C：接种量，D：摇床转速)：

Y(E24)=-675.78+126.81A+9.23B+

12.39C+0.80D-0.001 7AB-0.11AC+

0.001 6AD-0.002 5BC+0.000 3BD+

0.017CD-8.77A2-0.11B2-1.37C2-

0.002 8D2．

(2)

由表3可看出，本实验所选用模型的P值<0.000 1具有高度的显著性；该模型的单因素中A(pH值)、B(温度)、C(接种量)对响应值(E24)的影响显著，FpH= 340.24 >F温度= 142.33 >F接种量= 6.66 >F摇床转速= 0.35，二次项A2,B2,C2和D2的影响也十分显著.该模型的失拟率仅为0.01%，表明分析得到的回归方程符合实验实际情况，可用该方程代替真实函数对实验结果进行预测和探究.

表3 回归模型的方差分析

表4 回归模型的可信度分析

2.3 菌种培养条件的优化

利用软件对表2的实验数据进行二次多元回归拟合后，得到本实验模型的3D响应曲面及等高线图，通过分析研究可以得到各因素之间的交互作用并且确定其最优值.两因素间交互作用的显著程度被等高线图直观地反映出，即交互作用显著呈椭圆形，不显著呈圆形.故由等高线图可知pH值和接种量、pH值和摇床转速、温度和摇床转速、温度和接种量、接种量和摇床转速两因素的交互作用显著.

由图2中的3D响应曲面可知，A，B，C和D存在极值点，利用Design Expert软件，对乳化指数E24(Y)的二次多项式模型解逆矩阵可知，响应值Y越大越好.经软件分析或回归方程求导得到优化结果，可得A，B，C和D对应实验值A=7.2，B=43.5 ℃，C=5.2%，D=162 r/min.在此培养条件下，分析后响应值Y达最大值，预测Ymax=78.86%.

(a) 3D响应曲面图

(b) 等高线图

2.4 追加实验

在响应面分析得到的S2菌株最佳培养条件下进行追加实验，通过追加实验测得：由S2菌产生的生物表面活性剂的最佳E24为81.20%，较Abouseoud[8]得到的65%与Ansari[9]得到的70%有了很大的提高；S2菌株产生的生物表面活性剂的最佳产量为1.26 g/L(不在最佳条件下测得生物表面活性剂产量为0.72 g/L)；S2菌株的发酵液的表面张力从72.0 mN/m减少至25.8 mN/m.

3 结 论

通过离子鉴别实验及傅里叶红外光谱分析法对高产生物表面活性剂菌株S2产生的生物表面活性剂进行定性检测，确定其为非离子型脂肽类.采用响应面法进行了S2菌株发酵培养条件的优化实验，通

过Box-Behnken实验设计和Design Expert 8.0.5软件分析确定出主要影响因素的最优值，即pH为7.2、温度为43.5 ℃、接种量为5.2%(V/V)、摇床转速为162 r/min.由因素实验水平和显著性分析可知，pH值、温度、接种量对S2菌株产生发酵液的乳化指数E24有显著影响，其中pH值对其影响最大.在最佳培养条件下，S2菌株所产生物表面活性剂的最佳E24为81.20%、生物表面活性剂的产量从0.72 g/L增加至1.26 g/L、发酵液的表面张力从72.0 mN/m减少至25.8 mN/m.模型的实验值接近回归方程计算得到的预测值，说明该回归方程能够反映实际情况中各因素对响应值的影响，故采用响应面法优化S2菌株的培养条件具有高效性和可行性.

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Optimization of Culture Conditions of S2 Strain by Response Surface Method

LIU Jiang-hong1†, REN Jing-wei1, JIA Yun-peng2, YANG Lin-feng3, YU Bo1,LI Hang4

(1. Provincial Key Laboratory of Oil and Gas Chemical Technology, College of Chemistry and Chemical Engineering, Northeast Petroleum Univ, Daqing ，Heilongjiang 163318 China；2.Research Institute of Petroleum Engineering, Dagang Oilfield,Tianjin 300280 China；3.Daqing Urban Drainage Company, Daqing, Heilongjiang 163318, China；4.College of Mathematics and Statistics, Northeast Petroleum Univ， Daqing， Heilongjiang 163318,China )

S2 strain that highly produces biosurfactant was screened from the oilfield water of three plants in Daqing Oilfield in the rapid screening method, and the S2 strain was identified as Bacillus sp.. Through FT-IR and ion identification test, S2 biosurfactant was identified as nonionic lipopeptide biosurfactant. This experiment treated emulsification index (E24) of S2 strain fermentation broth as the object. Through response surface optimization method, the culture conditions (inoculum, pH, temperature and rotation speed) of the S2 strain were optimized. On the basis of response surface model, the optimum pH value was 7.2 and the temperature was 43.5 ℃, inoculation of 5.2% (V/V), rotation speed was 162 r/min through the quadratic regression equation. Under the optimal condition, the bestE24of S2 strain fermentation broth was 81.20%．

fermentation broth; infrared spectral measurements; response surface experiments; emulsification; strain

1674-2974(2015)06-0096-05

2014-06-30

黑龙江省教育厅科技公关项目(12531064)

刘江红(1966-)，女，黑龙江绥化人，东北石油大学教授

†通讯联系人，E-mail:ljhread@126.com

TE357

A