地塞米松对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪的影响

佟 杰，王 刚，于 颖,3，张 冲,2，常亚飞，刘永刚，涂亚斌，汤艳东，姜成刚，王淑杰，蔡雪辉*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001；2.吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118；3.西北农林科技大学 动物医学学院，陕西 杨凌 712100)

高致病性猪繁殖与呼吸系统综合征(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS)是由HP-PRRS 病毒(HP-PRRSV)引起的猪病毒性传染病。HP-PRRSV 主要感染猪单核巨噬细胞系统，引起仔猪的明显发病特征为持续高热和免疫抑制，尤其是免疫抑制的出现对防制该病造成了很大的阻碍[1-2]。本实验室前期研究表明，HP-PRRSV HuN4 株感染断奶仔猪可引起胸腺萎缩、胸腺细胞大量凋亡、外周血CD4+/CD8+显著下调[1-3]、外周免疫器官损伤并伴有淋巴细胞凋亡[4]，同时伴有大量炎性因子(IL-lβ、IL-6 和TNF-α 等)分泌[2,5]。

糖皮质激素是由肾上腺皮质束状带分泌的一类甾体激素，其通过与细胞质内的特异性受体结合形成复合物来发挥作用[6]。本实验室前期研究表明，HP-PRRSV HuN4 株感染断奶仔猪7 d 后，外周血中糖皮质激素含量显著升高，并且与促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 及外周血淋巴细胞凋亡具有一定相关性，但经典病毒株感染并无类似变化(待发表资料)。

地塞米松(DEX)是一种在临床中应用十分广泛的糖皮质激素类似物，具有抑制免疫应答、抗炎、抗过敏及抗休克等作用[6-8]，目前主要应用于危重疾病的急救和各类炎症的治疗。本研究通过在不同时间对感染HP-PRRSV HuN4 株的断奶仔猪肌肉注射糖皮质激素类似物DEX，分析其对HP-PRRSV 感染仔猪的发病影响，为全面研究HP-PRRSV 的致病机理和临床治疗提供新的实验依据。

1 材料和方法

1.1 病毒株及实验动物 HP-PRRSV HuN4 株由本实验室保存，病毒滴度为1×105TCID50/mL；17 头30 日龄的PRRSV 抗原、抗体阴性的健康断奶仔猪购自哈尔滨周边PRRSV 抗原抗体阴性猪场。

1.2 主要试剂 DEX 磷酸钠注射液(5 mg/mL)购自哈药集团制药六厂；禽源反转录酶(AMV)、RNA酶抑制剂、Ex Taq DNA 聚合酶(Hot Start Version)购自TaKaRa 公司；猪白介素 1β(IL-1β)、IL-6、TNF-α ELISA kit 购自Cloud Clone-Corp(USA)公司；Anti-pig CD4-FITC antibody、Anti-pig CD8-R-PE antibody、Anti-pig CD3-SPRD antibody 购自Southern Biotech 公司。

1.3 实验设计 17 头30 日龄的健康断奶仔猪随机分为5 组，HuN4+DEX(H)组5 头，HuN4+DEX(L)组3 头，DEX+HuN4 组2 头，HuN4 单独感染组4头，空白对照组3 头。具体实验设计见表1。每日观察临床症状并测量直肠温度，并于感染后0、3 d、7 d、10 d 前腔静脉采血。第14 d 全部迫杀。

表1 实验分组设计Table 1 Experimental design

1.4 外周血病毒载量的检测 将新鲜采集的抗凝血按照RNA 提取试剂盒说明书提取总RNA。采用荧光定量RT-PCR 方法检测外周血中的病毒载量[9]。

1.5 血清中细胞因子蛋白含量的检测 按照ELISA试剂盒说明书对血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 进行检测，每个样品重复两孔，重复试验两次。

1.6 外周血淋巴细胞亚群的检测 参考文献[3]，采用流式细胞术检测外周血中淋巴细胞亚群的变化。

2 结果

2.1 临床症状及剖检病变 HuN4+DEX(H)组、HuN4+DEX(L)组及DEX+HuN4 组均在感染后2 d开始呈现40 ℃以上高热，与HuN4 组相比，体温无显著差异(图1A)。HuN4+DEX(H)组、HuN4+DEX(L)组及DEX+HuN4 组在感染后14 d 内全部死亡(图1B)，病死猪病理变化明显：肺脏淤血，肉样变；胸腺严重萎缩，腹股沟和颌下淋巴结肿大，部分猪脾脏肿大出现坏死(表2)。HuN4 单独感染组眼观发病症状明显，DEX 注射组部分实验猪出现明显的耳部发绀症状。

表2 实验猪剖检病变Table 2 Gross lesions of experimental piglets in all groups

图1 感染后实验猪体温(A)和存活率(B)变化曲线Fig.1 Changes of temperature curve(A)and survival proportion of piglets(B)during HP-PRRSV infection

2.2 外周血中病毒载量 采用荧光定量RT-PCR 检测各组实验猪外周血中病毒载量。结果显示，DEX+HuN4 组病毒载量在病毒感染后7 d 达到107.5拷贝/mL，10 d 达到109.5拷贝/mL。其他DEX 注射组与HuN4 单独感染组相比无明显变化，空白对照组未检测到病毒(图2)。

图2 病毒感染后不同时间外周血病毒载量Fig.2 Viral RNA loads in peripheral blood of piglets

2.3 外周血中促炎性细胞因子变化 采用ELISA法对外周血中促炎性细胞因子进行检测，结果显示，于感染后3 d，HuN4 单独感染组外周血中主要的促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白含量开始上升，7 d 明显升高。DEX 注射组与空白对照组相比，各炎性因子的蛋白水平均有一定程度上升，但均低于HuN4 单独感染组(图3)。该结果表明DEX 对HP-PRRSV 引起的炎性反应起到了一定的抑制的作用。

2.4 外周血中淋巴细胞亚群变化 采用流式细胞术对外周血中淋巴细胞亚群进行检测，结果显示，于感染后7 d，HuN4 单独感染组猪外周血中的CD4+CD8-细胞比例显著减少，由19.8%减少到6.1%(p<0.05)(图4A)，而CD4-CD8+细胞比例显著增加，由27.6%增加到69.2 %(p<0.05)(图4B)，CD4+CD8+细胞比例先减少后增加(图4C)。DEX 注射组与HuN4 单独感染组变化趋势相似，但均有所缓和。

图3 外周血中促炎性细胞因子水平变化(a,b：不同字母表示差异显著，p<0.05)Fig.3 Concentration of pro-inflammatory cytokines in peripheral blood(a,b:values with different letters were significantly different,p<0.05)

图4 外周血内淋巴细胞亚群比例(a,b：不同字母表示差异显著，p<0.05)Fig.4 Proportion of lymphocyte subsets in peripheral blood(a,b:values with different letters were significantly different,p<0.05)

3 讨论

HP-PRRSV 感染会引起仔猪体温高热、胸腺萎缩及淋巴细胞发生大量凋亡[10]。病毒感染与机体的相互作用十分复杂，通常是以免疫系统为主，神经内分泌系统辅助参与调节的过程。神经-内分泌-免疫环路中，最重要的中心环节即为下丘脑-垂体-肾上腺系统(HPA 轴)[11-12]，其主要的调控机制是通过控制以糖皮质激素为主的一系列内分泌激素的释放影响细胞内靶基因，如促炎性细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α 的转录以及NF-kB、MAPK 等信号通路的激活，从而达到参与调节机体在病原微生物感染后的免疫功能[12]。

糖皮质激素具有一定的免疫抑制作用，可以起到退热消炎的效果，但有报道表明，在流感病毒感染的小鼠中，过量的糖皮质激素虽然可以部分缓解炎症反应，但却使病毒的复制增强，从而加重了病毒载量升高引起的病理损伤[13]。在本实验中，通过采用不同剂量的糖皮质激素类似物DEX，观察其对HP-PRRSV 感染后的仔猪临床发病症状和免疫系统淋巴细胞亚群的影响。结果表明，连续7 d 使用低剂量糖皮质激素，造成了感染仔猪机体内3 种主要的促炎性细胞因子水平下降，加强了病毒的复制，从而使病毒感染造成的损伤加重，造成仔猪死亡。但促炎性细胞因子引起病毒复制增强的具体机制仍有待于进一步研究。另外本实验对临床用药也具有一定的指导意义，作为临床中的常用药，DEX 的使用具有严格限制。本实验中连续7 d 低剂量注射DEX 会造成仔猪机体免疫抑制，增加其死亡率，因此证实不当使用激素类药物会造成病毒感染加重。目前，一些饲料添加剂中由于含有糖皮质激素，而引起动物感染病毒后病情加重的现象可能也与这一机制有关。

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