高特异性聚合酶链反应法鉴别大、小黄鱼鱼鳔及其混淆品

阎 婷，李 娜，贾景明，胡高升#（.沈阳药科大学中药学院，沈阳 006；2.辽宁医学院药学院，辽宁 锦州 200）

鱼鳔又称鱼白、鱼胶和鱼肚，为石首鱼科黄鱼属动物大黄鱼[Pseudosciaena crocea（Richardson）]、小黄鱼（P.polyactisBleeker）或鲟科鲟鱼属动物中华鲟（Acipenser sinensisGray）和鳇属动物鳇鱼[Huso dauricus（Georgi）]等的鱼鳔[1]。鱼鳔作为贵重动物药材，不仅是筵席名菜，亦有很好的滋补作用和药用价值，如滋阴养血、止血补血和补肾益精等[2-3]。由于鱼鳔商品来源复杂，市场上混淆品较多，仅仅根据形态特征来进行鉴别鱼鳔真伪已不能满足市场需求[4]。随着分子标记技术的发展，运用DNA分子遗传标记技术鉴别中药材的真伪已被广泛认可[5-7]。为了建立鱼鳔药材准确鉴别方法，本研究采用高特异性聚合酶链反应（PCR）技术对鱼鳔药材及其混淆品进行了DNA分子遗传标记鉴别。采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取8种供试品鱼鳔的DNA，并对其线粒体12S rRNA 基因进行特异性扩增，为经济适用、准确便捷和高稳定性地鉴别鱼鳔种属来源提供依据，同时有利于鱼鳔药材的质量控制。

1 材料

1.1 仪器

Hema 9600型梯度基因扩增仪、TGL-16R/18R型冷冻高速冷冻离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；HE-120 型多功能水平电泳槽、EPS300型电泳仪（上海天能科技有限公司）。

1.2 药材

大、小黄鱼鱼鳔来源于市场购买的大黄鱼、小黄鱼、混淆品鱼鳔来源于市场购买的青鱼、鲅鱼、鲤鱼、草鱼、鲢鱼和鲫鱼，正品、混淆品均经沈阳药科大学中药学院贾景明教授鉴定为真品。

1.3 试剂

PCR 试剂盒、DNA MarkerⅢ均购自北京康为世纪生物科技有限公司；琼脂糖（香港基因有限公司）；溴化乙锭（上海生工生物科技有限公司）；所用引物订购于生工生物工程（上海）有限公司。

2 方法

2.1 大、小黄鱼鱼鳔高特异性PCR鉴别引物的设计

从GenBank 下载大、小黄鱼及混淆品青鱼、鲅鱼、鲤鱼、草鱼、鲢鱼、鲫鱼的线粒体12S rRNA 基因序列（GenBank 登录号依次为：FJ595214.1、FJ618559.1、NC_011141.1、NC_016420.1、AP009047.1、HQ891005.1、NC_010156.1、AB045144.1）。经DNAMAN 软件进行多序列比对，分析正品、混淆品间DNA 序列差异，在差异较大区域设计特异性引物，在保守序列处设计通用引物。大黄鱼鱼鳔的特异性引物为Fish-F1（5′-ATCAGGCACAACCAACCATAG-3′）和FishD-R1（5′-GACATGTATTTCAGTATGTCA-3′）；小黄鱼鱼鳔的特异性引物为Fish-F1和FishX-R2（5′-GACATGTGTTTCAGCATGTTA-3′）。通用引物及 序 列 为：Univ-F（5′-AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3′）和Univ-R（5′-GAGAGTGACGGGCGGTGTGT-3′）。大、小黄鱼及其混淆品12S rRNA部分序列见图1（实线箭头部分为特异性引物，虚线箭头部分为通用引物）。

图1 大、小黄鱼及其混淆品12S rRNA部分序列Fig 1 Multiple alignment of 12S rRNA sequences of P.crocea，P.polyactis and their adulterants

2.2 模板DNA的提取

取大、小黄鱼及混淆品青鱼、鲅鱼、鲤鱼、草鱼、鲢鱼和鲫鱼的鱼鳔组织约50 mg，采用CTAB 法[8]提取基因组总DNA，并稍作改进。将供试品鱼鳔组织分别置于研钵中，加液氮研磨成粉末状。在1.5 ml 离心管中分别加入1 ml 65 ℃预热CTAB裂解液[CTAB 2%，Tris-HCl 100 mmol/L，乙二胺四乙酸（EDTA）10 mmol/L，NaCl 1.4 mol/L，用前加2%β-巯基乙醇]，将研磨成粉的鱼鳔组织迅速加入该离心管中，充分混匀后置65 ℃水浴1 h，期间每隔20 min 颠倒振荡1 次。水浴结束后，在离心管中加500 μl 氯仿-异戊醇（24 ∶1，V/V），振荡后以离心半径为12 cm、12 000 r/min 离心15 min。取上清液，加等体积异丙醇，摇匀后室温静置5 min，以离心半径为12 cm、12 000 r/min 离心5 min，弃上清液，得到DNA 沉淀，加入750 μl 75%乙醇洗涤2 次，沉淀风干后溶于20 μl TE 缓冲液中，用琼脂糖凝胶电泳检测，－20 ℃贮藏，备用。

2.3 高特异性PCR鉴别方法

PCR 反应体系10 μl，其中10×PCR 无Mg2+的缓冲液1 μl，高纯dNTP（2.5 mmol/L）0.8 μl，Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.1 μl，MgCl2（25 mmol/L）0.8 μl，引物Fish-F1、FishD-R1 或引物Fish-F1、FishX-R2 各0.2 μl（10 μmol/L），模板1 μl，无菌水5.9 μl。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。选用不同的复性温度以寻找合适的PCR 鉴别反应参数。实验中设置不含DNA模板的阴性对照。取2 μl 反应液经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭荧光（EB）染色，紫外分析检测，成像。同时用扩增约420 bp 的12S rRNA 基因片段的通用引物Univ-F 和Univ-R 在55 ℃的复性温度下对上述用于PCR 鉴别的模板DNA作阳性扩增对照。

3 结果

3.1 模板质量的检测

大、小黄鱼鱼鳔及混淆品提取的DNA 模板用通用引物Univ-F 和Univ-R扩增，得到约420 bp扩增带，与理论预测大小一致，表明样品中模板DNA 质量符合PCR反应的要求。通用引物Univ-F 和Univ-R 扩增的PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图见图2。

图2 通用引物Univ-F 及Univ-R 扩增的PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图M.DNA marker；1.大黄鱼；2.小黄鱼；3.青鱼；4.鲅鱼；5.鲤鱼；6.鲢鱼；7.草鱼；8.鲫鱼Fig 2 Agarose gel electrophoresis of PCR product using general primer Univ-F and Univ-RM.DNA marker；1. P.crocea；2. P.polyactis；3. Mylopharyngodon piceus；4. Scomberomorus niphonius；5. Cyprinus carpio；6. Hypophthalmichthys molitrix；7. Ctenopharyngodon idellus；8. Ctenopharyngodon idellus

3.2 高特异性PCR鉴别

3.2.1 大黄鱼鱼鳔 用大黄鱼鱼鳔特异性引物PCR 扩增8种供试鱼鳔的DNA，当复性温度分别为50.7 ℃和55.5 ℃时，大黄鱼鱼鳔和小黄鱼鱼鳔均有1条带；当复性温度升至60.4 ℃、30个循环时，其反应具有高度特异性，仅大黄鱼鱼鳔有良好的单一扩增带，其余样品皆无扩增带出现。故特异性PCR 循环参数确定为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60.4 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；72 ℃延伸5 min。经PCR 循环，得670 bp 的扩增带。因此，依据鉴别引物扩增模板DNA有无扩增条带即可确定受试样品是否为大黄鱼鱼鳔。大黄鱼鱼鳔特异性引物Fish-F1 及FishD-R1 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图见图3。

图3 大黄鱼鱼鳔特异性引物Fish-F1 及FishD-R1 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图M.DNA marker；1.大黄鱼；2.小黄鱼；3.青鱼；4.鲅鱼；5.鲤鱼；6.鲢鱼；7.草鱼；8.鲫鱼；9.阴性对照Fig 3 Agarose gel electrophoresis of PCR product using specific primers Fish-F1 and FishD-R1 of swimming bladder of P.croceaM.DNA marker；1. P.crocea；2. P.polyactis；3. Mylopharyngodon piceus；4.Scomberomorus niphonius；5.Cyprinus carpio；6.Hypophthalmichthys molitrix；7. Ctenopharyngodon idellus；8. Ctenopharyngodon idellus；9.negative control

3.2.2 小黄鱼鱼鳔 用小黄鱼鱼鳔特异性引物PCR 扩增8种供试鱼鳔的DNA，当复性温度分别为61 ℃和62.4 ℃时，大黄鱼鱼鳔和小黄鱼鱼鳔均有1条带；当复性温度升至64.8 ℃、30个循环时，其反应具有高度特异性，仅小黄鱼鱼鳔有良好的单一扩增带，其余样品皆无扩增带出现。故特异性PCR 循环参数确定为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，64.8 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。经PCR循环，得670 bp 的扩增带。因此，依据鉴别引物扩增模板DNA 有无扩增条带即可确定受试样品是否为小黄鱼鱼鳔。小黄鱼鱼鳔特异性引物Fish-F1 及FishX-R2 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图见图4。

4 讨论

本研究运用CTAB法提取了8种供试鱼鳔的DNA，该方法操作简便、快捷，且能够满足PCR需要。

图4 小黄鱼鱼鳔特异性引物Fish-F1 及FishX-R2 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图M.DNA Marker；1.小黄鱼；2.大黄鱼；3.青鱼；4.鲅鱼；5.鲤鱼；6.鲢鱼；7.草鱼；8.鲫鱼；9.阴性对照Fig 4 Agarose gel electrophoresis of PCR product using specific primers Fish-F1 and FishX-R2 of swimming bladder of P.polyactisM.DNA marker；1. P.polyactis；2. P.crocea；3. Mylopharyngodon piceus；4. Scomberomorus niphonius；5. Cyprinus carpio；6. Hypophthalmichthys molitrix；7. Ctenopharyngodon idellus；8. Ctenopharyngodon idellus；9.negative control

为实现准确鉴别鱼鳔真伪的目的，本研究寻找市场上充伪频率高、价格低廉、外观形态上与大、小黄鱼相近的品种进行了PCR鉴别。结果表明，运用DNA 分子标记技术能够准确鉴别大、小黄鱼鱼鳔和其他混淆品，为鱼鳔药材质量标准的制定提供了依据。研究还发现，若将这两对特异性引物分别配成鉴别试剂盒，PCR 时只需加入模板，反应完成后即可直接电泳，使鉴别反应更加简化、便捷，可为各级药检所鉴定药材真伪提供参考。

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