黄芪多糖缓释纤维对成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响

王相峰，刘童斌，陈亚丹，付秀娟（.吉林大学第二医院，长春 3004；.吉林大学口腔医院，长春 3004）

黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，AP）是黄芪中最重要的天然有效成分。随着对多糖研究的深入，发现多糖具有多方面的生物活性及功能。AP也因其在抗骨质疏松、增强机体免疫力、抗衰老、降血糖等方面有较强的活性而备受关注[1-2]。有研究报道，黄芪水提液能够促进骨形成[3]，AP能促进大鼠原代成骨细胞的增殖、分化与矿化[4-5]，适宜浓度的AP 在短期内对体外牙周膜细胞的增殖也具有一定的促进作用[6-9]。

临床上中老年患者行种植牙手术时，其骨量骨质的条件往往不理想。目前，最理想的骨修复方式是自体骨移植，但供需骨的丧失和二次手术等缺陷限制了其应用[10]。组织工程技术作为一种新的再生模式，为牙周骨缺损的修复重建提供了新思路。左旋聚乳酸（PLLA）是一种可降解生物高分子材料，具有机械性能良好、可降解等特点，被广泛应用于医疗行业；电纺丝作为一种新兴的技术手段，操作简易，可制备包裹有效药物成分的可控、缓释药物的复合材料。乳液法电纺丝技术是基于高压静电纺丝发展而来，将药物加入静电纺丝纤维中，药物分散均匀，缓释效果较好，且具备经济实惠、制备方法简单的优势。因此，本研究将AP 与PLLA 结合制成AP 缓释纤维，通过考察AP 缓释纤维的体外释放以及其对成骨细胞MC3T3-E1的黏附、增殖和分化的影响，初步探讨AP缓释纤维用于种植体周骨缺损修复的可行性。

1 材料

1.1 仪器

静电纺丝推进装置（北京铠为信科技有限公司）；超纯水仪（美国Millipore 公司）；HZQ-X100 型恒温震荡培养箱（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；Micrion FEI PHILIPS场发射扫描电子显微镜（美国FEI公司）；TU-1810紫外-可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；TGL-16G-A离心机（上海安亭公司，离心半径：3.5 cm）；MCO-18AIC（UV）型CO2培养箱（日本三洋电机株式会社）；倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；恒温水浴箱（上海医疗器械五厂）。

1.2 药品与试剂

PLLA（上海丽昂化学有限公司，批号：320140124，纯度：＞95%）；AP（南京景竹生物科技有限公司，批号：20131022，纯度：90%）；胰酶（宝泰克生物有限公司，批号：20140411，分析纯）；高糖达尔伯克改良伊格尔（DMEM）培养基（美国Gibco 公司，批号：126H4526D）；MTT（宝泰克生物有限公司，批号：20131102，分析纯）；碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20140523）；异硫氰酸荧光素（FITC，美国Sigma 公司，批号：F1407295）；磷酸盐缓冲液（PBS，长春汇力生物技术有限公司，批号：720140625）；二甲基亚砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）、三氯甲烷，油酸山梨坦等试剂均为分析纯，购自北京化工厂。

1.3 细胞

小鼠成骨细胞MC3T3-E1 细胞系由中国科学院细胞库提供。

2 方法

2.1 缓释纤维的制备

常温下用8 ml三氯甲烷溶解1 g PLLA，充分溶解后，加入3 mlN，N-二甲基甲酰胺、30 μl油酸山梨坦，搅拌均匀作为外油相。将AP 溶于PBS 中制备成质量浓度分别为0、25、50、100 μg/ml 的溶液，作为内水相。将0.5 ml 内水相逐滴加至外油相中，采用磁力搅拌30 min，形成W/O型乳液。将乳液加入静电纺丝推进装置，加高压静电20 kV，室温下静电纺织为纤维薄膜，晾干，制得缓释纤维。分别依次记为PLLA（0 μg/ml AP）、PLLA/AP1（25 μg/ml AP）、PLLA/AP2（50 μg/ml AP）、PLLA/AP3（100 μg/ml AP），备用。

2.2 缓释纤维的形态观察

将PLLA、PLLA/AP1、PLLA/AP2、PLLA/AP3 分别裁剪成5 mm×5 mm大小，将纤维样品固定在导电胶上，经过喷金后，在扫描电子显微镜下观察其表面形态，电子加速率为15 kV。

2.3 缓释纤维的AP体外释放试验

精密称量PLLA/AP1、PLLA/AP2、PLLA/AP3 各0.2 g，分别浸泡在装有10 ml 模拟体液的塑料管中，37 ℃水浴震荡，分别于1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 d取出浸提液，然后加入同温度同体积的模拟体液。将取出的浸提液采用苯酚-浓硫酸法显色，在490 nm波长处测定AP的吸光度，计算释放度[11]，绘制体外释放曲线。

2.4 细胞在AP缓释纤维上的黏附考察

将FITC混入AP质量浓度为50 μg/ml的内水相中，使其质量浓度为1 μg/ml，其余步骤同“2.1”项下方法制备成AP 缓释纤维，记为PLLA/AP/FITC。使用特制打孔器在PLLA/AP/FITC 上取直径为30 mm 的纤维膜，正反面分别进行紫外线照射消毒。纤维膜用MC3T3-E1 细胞培养液浸泡1 h 后，置于6孔板中，将MC3T3-E1 细胞（1.0×105个/孔）接种于纤维膜上。将6 孔板置于37 ℃下含5%CO2细胞培养箱中培养4 h，用PI染色，置于荧光显微镜下观察MC3T3-E1 细胞在AP 缓释纤维上的黏附情况。

2.5 缓释纤维对MC3T3-E1细胞增殖的影响

试验分为4 组，即PLLA 组、PLLA/AP1 组、PLLA/AP2 组、PLLA/AP3 组。使用特制打孔器在PLLA、PLLA/AP1、PLLA/AP2、PLLA/AP3纤维膜上分别取得直径为8 mm的纤维膜，每组6 份，将纤维正反面紫外线照射消毒后置于96 孔板内，将MC3T3-E1细胞（4×103个/孔）接种于纤维膜上，将96孔板置于37 ℃下含5%CO2的细胞培养箱中培养。分别在24、48、72 h时每孔加入20 μl MTT，放入培养箱继续培养4 h后，将培养液吸出，每个样品加入DMSO 150µl，室温下振荡10 min，加样于96 孔板中，用酶标仪测定570 nm 波长处的光密度，考察MC3T3-E1细胞的增殖情况。

2.6 缓释纤维对MC3T3-E1细胞中ALP活性的影响

试验分组同“2.5”项。使用特制打孔器在PLLA、PLLA/AP1、PLLA/AP2、PLLA/AP3 纤维膜上分别取直径15 mm 的纤维膜，每组6份，将纤维正反面紫外线照射消毒后置于24孔板内，将MC3T3-E1细胞（1×104个/孔）接种于纤维膜上，将24孔板置于37 ℃下含5%CO2的细胞培养箱中培养。分别在3、5、7 d时用0.25%胰蛋白酶消化2 min，加培养液终止消化。将所有液体及细胞转入EP 管，1 000 r/min 离心10 min，弃上清，留沉淀细胞，加入1 ml PBS轻轻吹打，再次离心10 min，弃上清，在细胞沉淀中加入200 μl PBS，反复冻融3次。按ALP试剂盒操作步骤加样于96孔板中，用酶标仪测定520 nm波长处的光密度，计算ALP活性。

2.7 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，采用SigmaPlot 12.5软件作图。结果以表示，组间采用t检验。检验标准α＝0.05，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 缓释纤维形态学表现

扫描电镜图中显示，PLLA 可见纤维连续，彼此有较多空隙，表面光滑；PLLA/AP1、PLLA/AP2、PLLA/AP3 的纤维呈纵横交错的三维、多空网络结构，与PLLA 比较纤维的粘连程度降低，直径均一性降低，且3 种AP 载药量下纤维形态未见明显改变。扫描电镜图见图1。

图1 扫描电镜图（×500）Fig 1 Fluorescence microgram（×500）

3.2 体外释放试验结果

结果显示，PLLA/AP1、PLLA/AP2、PLLA/AP3 中AP 第1天的累积释放度分别为37%、38%、40%，第7天的累积释放度分别为72%、73%、75%，第21 天的累积释放度均在90%左右。表明第1 周AP 释放较快，随后释放速率减慢。在最初的1 d 内，AP 的释放呈现一种突释状态，其中PLLA/AP3 较PLLA/AP1 和PLLA/AP2 的释药速度略快。AP 缓释纤维的药物释放曲线见图2。

图2 AP缓释纤维的药物释放曲线Fig 2 Drug release curve of AP sustained-release fiber

3.3 细胞在PLLA/AP/FITC上的黏附情况

结果显示，MC3T3-E1 细胞能在PLLA/AP/FITC 上黏附生长，呈不规则多边形，细胞与纤维结合牢固。荧光显微镜图见图3。

图3 荧光显微镜图（×400）Fig 3 Fluorescence microgram（×400）

3.4 MC3T3-E1细胞的增殖情况

与PLLA 比较，PLLA/AP2、PLLA/AP3 能促进MC3T3-E1细胞的增殖，而PLLA/AP1仅作用48 h时能促进MC3T3-E1细胞的增殖，差异具有统计学意义（P＜0.05），且作用与AP 质量浓度呈正相关。各组MC3T3-E1细胞的增殖情况见表1。

表1 各组MC3T3-E1细胞的增殖情况（，n＝6）Tab 1 The proliferation of MC3T3-E1 in each group（，n＝6）

表1 各组MC3T3-E1细胞的增殖情况（，n＝6）Tab 1 The proliferation of MC3T3-E1 in each group（，n＝6）

注：与PLLA组比较，＊P＜0.05Note：vs.PLLA group，＊P＜0.05

3.5 MC3T3-E1细胞中ALP活性的变化

与PLLA 比较，PLLA/AP1、PLLA/AP2、PLLA/AP3 均能增强MC3T3-E1 细胞中ALP 活性表达，差异具有统计学意义（P＜0.05），且与AP 浓度呈正相关。各组MC3T3-E1 细胞中ALP活性表达情况见表2。

表2 各组MC3T3-E1细胞中ALP活性表达情况（，n＝6，u/L）Tab 2 Expression of ALP in MC3T3-E1 each group（，n＝6，u/L）

表2 各组MC3T3-E1细胞中ALP活性表达情况（，n＝6，u/L）Tab 2 Expression of ALP in MC3T3-E1 each group（，n＝6，u/L）

注：与PLLA组比较，＊P＜0.05Note：vs.PLLA group，＊P＜0.05

4 讨论

大量基础研究表明，AP卓越的促成骨功能使之具有较好的临床应用前景[3-9]。孔祥鹤等[5]的研究发现不同质量浓度（0.1、0.3、1、3、10、30、100 μg/ml）的AP能够促进大鼠原代成骨细胞的增殖、分化及矿化。刘豫蓉等[4]分别用0.08、0.1、0.2、0.4 mg/ml的AP作用于体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞，发现AP在短期内对体外成骨细胞的增殖与分化具有一定的促进作用。许春姣等[8]的研究发现，AP（50 μg/ml）与壳聚糖/聚乳酸制成复合材料能够促进犬牙周缺损部位的骨形成。为此，本研究选择25、50、100 μg/ml 的AP 与PLLA 相结合，制备AP 缓释纤维。

AP缓释纤维在模拟体液的作用下，PLLA缓慢降解，AP不断从纤维表面释放出来。AP缓释纤维的体外释放试验结果表明，释放大致分为两个阶段，即突释期和稳定期。第1天AP累积释放度约为40%；第2～5天进入释放稳定期，每天释放量约为10%。此时纤维表面形成的孔洞有利于药物进一步缓慢释放，AP 的释放呈现相对规律的状态。5 d 后，释放速率进一步降低。笔者推测：最初的突释状态可能是由于纤维表面AP的释放以及纤维所具有的高比表面积所引起的，而随后的平稳缓慢释放则是因为伴随着PLLA 的缓慢降解，从而AP 缓慢释放。这说明AP 缓释纤维具有良好的缓释效果。另外药物浓度与释放速率呈现一定程度的正相关。笔者认为：随着载药量的增加，释药速率增大，一是因为载药量大的纤维单位体积内AP 浓度高、药物扩散的浓度梯度大，这就更有利于纤维上的药物扩散、溶解到释放介质中[12]；二是因为载药量大的纤维，靠近表面的AP 增多，其首先释放完毕，在纤维表面形成较多的孔道，使得纤维内部的AP 扩散出来的几率增大[13]。从整个过程来看，AP缓释纤维可对AP起到缓释作用。

MC3T3-E1 细胞具有体外培养成骨细胞的各种生物学特性，是研究药物对成骨细胞影响的理想的体外细胞模型[14]。利用荧光染色可见MC3T3-E1 细胞在AP 缓释纤维上黏附生长，呈不规则的多边形，伪足伸展充分，细胞生长状态较好；但细胞间没有紧密联系，没有形成细胞团片。通过MTT比色分析发现，各PLLA/AP组能够显著地促进MC3T3-E1细胞的增殖，尤其是PLLA/AP3 组在各时间段均具有显著的促增殖作用（P＜0.05），说明AP缓释纤维能够有效促进MC3T3-E1细胞的增殖。ALP 是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，其高表达是成骨细胞分化成熟的早期标志。本研究表明，ALP的活性与AP的浓度成正比，随着AP浓度的增加，MC3T3-E1细胞ALP活性显著增加。该结果提示AP缓释纤维能够有效促进MC3T3-E1细胞的分化（P＜0.05）。

本研究表明，静电纺丝制备的AP缓释纤维具有一定的AP缓释能力，表面可以黏附MC3T3-E1细胞，并对细胞增殖、分化有促进作用。其制备过程简便、易于储存，因此有望应用于老年人种植体周骨缺损的修复，但仍需进行动物实验以进一步验证其可行性。

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