猪脑心肌炎病毒HB10 株cDNA 感染性克隆的构建

于会彬，黄 丽，张元峰，李江南，蔡雪辉，崔尚金，翁长江

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物病原监测与流行病学研究创新团队，黑龙江哈尔滨 150001)

猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)属于小RNA 病毒科，心病毒属，为无囊膜的单股正链RNA 病毒[1]。EMCV 基因组全长约7.8 kb，含一个开放阅读框(ORF)，编码一个多聚蛋白(L-1ABCD-2ABC-3ABCD)，多聚蛋白最终产生13 个成熟的病毒蛋白，前体蛋白P1 包含衣壳蛋白1A、1B、1C、1D。前体蛋白P2 和P3 包含EMCV 的非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C 蛋白酶和RNA 依赖的RNA 聚合酶3D[2]。

1945 年，在佛罗里达州的一个长臂猿体内首次分离到EMCV[3]，该病毒呈世界性分布，能够引起猪的急性、致死性心肌炎或母猪的繁殖障碍[4-5]。其致病性及引起的疾病主要取决于病毒和宿主两方面因素。最新研究表明，EMCV 2A 蛋白为EMCV 的毒力因子[6]，为进一步研究EMCV 2A 及其缺失突变对病毒致病性的影响，本研究利用反向遗传操作系统建立了EMCV-HB10 株的cDNA 感染性克隆，为深入研究EMCV 毒力因子及致病机理奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 EMCV-HB10 株由崔尚金研究员提供，第5 代病毒用于本实验研究；E.coli DH5α、低拷贝载体pOK12 及BHK-21 细胞均由本实验室保存；鼠抗VP1 单克隆抗体(MAb)由本实验室制备。

1.2 主要试剂 RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6 and T7 购自Promega 公司；RNA提取试剂TRIzol Reagent、Super Script III First-Strand Synthesis System 和Lipofectamine 2000 购自Invitrogen公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自QIAGEN 公司；Phusion High-Fidelity DNA Polymerase、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自NEB 公司；羊抗鼠FITC-IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 引物设计及基因合成 根据EMCV-HB10 全基因序列(GQ864080.1)，利用Primer5 软件设计一对引物扩增EMCV 全长基因组cDNA(表1)。引物及所有重组质粒测序均由上海英俊公司完成(全长测序引物序列信息如读者需要作者可以提供)。

1.4 EMCV-HB10 感染性重组质粒的构建 按照TRIzol 试剂说明书提取EMCV RNA，反转录制备cDNA，以EMCV-FL-F/EMCV-FL-R 为引物，采用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase PCR 扩增EMCV 全长基因组cDNA，回收纯化PCR 产物，经Eco RⅠ/Bam HⅠ酶切后克隆于载体pOK12 中，构建EMCV 感染性重组质粒pOK12-EMCV-HB10，并进行测序鉴定。EMCV-HB10 全长基因组cDNA 如图1所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

图1 含T7 启动子EMCV-HB10 全长基因组cDNA 结构图Fig.1 The full length cDNA of EMCV-HB10 with T7 promoter

1.5 RNA 体外转录及病毒的拯救 重组质粒pOK12-EMCV-HB10 经Bam HⅠ酶切线性化后，按照RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6 and T7 试剂盒说明书进行体外转录，采用酚-氯仿法抽提纯化RNA，按Lipofectamine 2000 说明书操作步骤将其转染于80 %的单层BHK-21 细胞，转染36 h 后，观察细胞病变(CPE)，并收获细胞上清，连续体外盲传5 代，拯救病毒命名为rEMCV-HB10。

1.6 拯救病毒的鉴定

1.6.1 拯救病毒的RT-PCR 测序鉴定 分别将F5 代0.1 mL 103TCID50的rEMCV-HB10 和EMCV-HB10感染BHK-21 细胞，提取总RNA，反转录制备cDNA，扩增全基因组进行测序，序列比对鉴定。

1.6.2 间接免疫荧光(IFA)鉴定 将F5 代rEMCVHB10 按常规方法感染80 %单层BHK-21 细胞12 h后，以鼠抗VP1 MAb(1∶200)为一抗，羊抗鼠FITCIgG(1∶100)为二抗，进行IFA 鉴定。同时设置无病毒感染细胞和EMCV-HB10 感染细胞作为对照。

1.6.3 拯救病毒的生长特性研究 分别将F5 代100 TCID50的rEMCV-HB10 和EMCV-HB10 感 染BHK-21 细胞，37 ℃孵育1 h 后换液，分别于不同时间点收集细胞上清，测定病毒TCID50，绘制病毒生长曲线。

2 结果

2.1 全长感染性克隆c DNA 重组质粒构建 提取EMCV RNA 反转录制备cDNA，以其为模板，利用EMCV-FL-F/EMCV-FL-R 引物进行PCR 扩增，结果显示扩增获得EMCV 基因组全长cDNA。将其克隆于载体pOK12 中，构建重组质粒pOK12-EMCVHB10，酶切鉴定结果显示重组质粒构建正确(图2)。

图2 全长EMCV cDNA 重组质粒的构建Fig.2 Construction of the full-length recombinant EMCV cDNA clone

2.2 病毒的拯救及RT-PCR 测序鉴定 重组质粒pOK12-EMCV-HB10 经Bam HⅠ酶切后进行体外转录，转染RNA 于80 %的单层BHK-21 细胞，结果显示，36 h 后出现典型CPE，细胞先呈葡萄状分布、最终崩解成碎片。分别将F5 代0.1 mL 103TCID50的rEMCV-HB10 和EMCV-HB10 感染BHK-21 细胞，对病毒全基因组进行测序，结果表明rEMCV-HB10仅1D 基因存在两个核苷酸突变A37G 和G187C，该突变可以作为鉴定rEMCV-HB10 的特异性标志。

2.3 拯救病毒IFA 鉴定 将EMCV-HB10 和rEMCVHB10 分别感染BHK-21 细胞后利用抗VP1 MAb 进行IFA 检测。结果显示，EMCV-HB10 和rEMCVHB10 感染的BHK-21 细胞均可以检测到特异性荧光(图3A 和3B)，而对照BHK-21 细胞则无特异性荧光(图3C)。

图3 rEMCV-HB10 的IFA 检测Fig.3 Identification of the rEMCV-HB10 by IFA

2.4 拯救病毒的生长特性研究 取F5 代100 TCID50EMCV-HB10 和rEMCV-HB10 感染BHK-21 细胞，于不同时间点收集细胞上清，测定其TCID50。绘制病毒生长曲线。结果显示，拯救病毒与亲本病毒株具有相似的生长特性(图4)。

图4 rEMCV-HB10 和EMCV-HB10 的生长曲线Fig.4 The growth curve of rEMCV-HB10 and EMCV-HB10

3 讨论

构建病毒cDNA 感染性克隆的关键是获得高质量的病毒RNA，准确扩增病毒全长cDNA。本研究采用高保真酶一次扩增病毒全长基因组cDNA，直接克隆于低拷贝载体pOK12 中。拯救病毒全基因组测序结果表明，仅1D 基因存在两个核苷酸突变，但并不影响病毒拯救。本研究相比其他复杂的分节段构建感染性克隆策略，节约时间和成本。利用该反向遗传平台可以实现对EMCV 基因组的改造，使得病毒基因组核苷酸的突变、基因的替换或缺失成为可能。

EMCV 5'UTR 含有一个独特Poly(C)区域，长度约60 nt～350 nt[7]。构建全长EMCV cDNA 克隆的难度之一在于扩增5' 端Poly(C)。已有研究表明，Poly(C)的长度不影响病毒在细胞中的生长特性[8]，但对病毒致病力有影响。本研究中rEMCV-HB10 基因组测序结果显示，该拯救病毒的Poly(C)序列长度为15 nt，亲本EMCV-HB10 的Poly(C)序列长度为24 nt。生长特性研究表明拯救病毒与亲本病毒的生长特性并无显著差异。EMCV 的3' 端的Poly(A)在感染中起到重要功能。RNA 的感染需要EMCV RNA 的Poly(A)，此外还可能具有保护mRNA 不被细胞内核酶降解和起始RNA 合成的作用。最近研究发现，只有7 nt Poly(A)的全长EMCV cDNA 克隆能够拯救出病毒，拯救病毒对小鼠具有致病性[9]。而本实验拯救病毒Poly(A)测序长度为15 nt，也可以拯救病毒。该拯救病毒对宿主的致病性还需要深入研究。

本研究构建了EMCV-HB10 株全长cDNA 感染性克隆，为进一步研究EMCV 基因的结构与功能、致病机理以及开发新型疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。

[1]Carocci M,Bakkali-Kassimi L.The encephalomyocarditis virus[J].Virulence,2012,3(4):351-367.

[2]Palmenberg A C,Kirby E M,Janda M R,et al.The nucleotide and deduced amino acid sequences of the encephalomyocarditis viral polyprotein coding region[J].Nucleic Acids Res,1984,12(6):2969-2985.

[3]Helwig F C,Schmidt C H.A filter-passing agent producing interstitial myocarditis in anthropoid apes and small animals[J].Science,1945,102(2637):31-33.

[4]Koenen F,De Clercq K,Lefebvre J,et al.Reproductive failurein sows following experimental infection with a Belgian EMCV isolate[J].Vet Microbiol,1994,39(1-2):111-116.

[5]Gelmetti D,Meroni A,Brocchi E,et al.Pathogenesis of encephalomyocarditis experimental infection in young piglets:a potential animal model to study viral myocarditis[J].Vet Res,2006,37(1):15-23.

[6]Carocci M,Cordonnier N,Huet H,et al.Encephalomyocarditis virus 2A protein is required for viral pathogenesis and inhibition of apoptosis[J].J Virol,2011,85(20):10741-10754.

[7]Duke G M,Osorio J E,Palmenberg A C.Attenuation of Mengo virus through genetic engineering of the 5' noncoding poly(C)tract[J].Nature,1990,343(6257):474-476.

[8]Duke G M,Palmenberg A C.Cloning and synthesis of infectious cardiovirus RNAs containing short,discrete poly(C)tracts[J].J Virol,1989,63(4):1822-1826.

[9]Kassimi L B,Boutrouille A,Gonzague M,et al.Nucleotide sequence and construction of an infectious cDNA clone of an EMCV strain isolated from aborted swine fetus[J].Virus Res,2002,83(1-2):71-87.