黑蜂王台病毒环介导等温扩增检测方法的建立

王向辉，隋佳辰，张 健，郑 言，杨 倩，宋战昀，王振国,

(1.吉林农业大学 动物科技学院，吉林 长春 130118；2.吉林出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，吉林 长春 130062)

蜜蜂黑蜂王台病毒(Black queen cell virus，BQCV)首次发现于死亡的蜂王幼虫和蛹中，春季和初夏多发[1-2]，主要引起封盖期蜂王幼虫病害，并被证明是导致澳大利亚蜂王幼虫死亡的最常见的病因[3]。目前针对BQCV 主要的检测技术有：基于发病症状的检测、免疫学检测、显微镜检测、针对核酸序列的检测。前3 种方法由于蜜蜂发病症状复杂、病毒基因具有一定同源性、样本处理复杂且费用昂贵等缺陷，不被广泛使用。而针对核酸序列的检测技术中，RT-PCR 和荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)技术被广泛应用，但灵敏度不足和检测耗时长对检测过程产生一定的影响[4-5]。环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是在等温条件下进行，具有特异、快速、操作简便等特点[6]。本研究针对BQCV VP 基因保守区设计LAMP 引物，通过加入SYBR Green I 荧光染料[7]，建立了可视化的检测BQCV 的LAMP 方法，为BQCV 病原学快速检测提供了技术手段。

1 材料和方法

1.1 病毒株及样品来源 BQCV-JL1 株、蜜蜂残翼病毒(DWV)、蜜蜂囊状幼虫病毒(SBV)、蜜蜂慢性麻痹病毒(CBPV)、蜜蜂急性麻痹病毒(ABPV)均由技术中心动植检实验室保存；被检40 份临床样品采集于部分省份蜂场。

1.2 主要试剂与仪器 SYBR Green I 购自Invitrogen公司；RNA 转录纯化试剂盒和PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 购自TaKaRa 公司；质粒pGEM-T easy 和Riboprobe System-T7 体外转录试剂盒购自美国Promega 公司；Omega Biotek 质粒小量提取试剂盒I 型购自广州飞扬生物工程有限公司；DNA LAMP Kit 及LA-320 型LAMP real-time Turbidimeter 仪购自日本荣源株式会社。

1.3 LAMP 引物设计与筛选 根据GenBank 登录的BQCV-JL1 株序列(KP119603.1)，选取BQCV 衣壳蛋白VP 基因序列中保守区域，采用Primer Explorer V4 软件设计引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

1.4 BQCV 核酸的提取及重组标准质粒的构建 按照TRIzol 法从病料中提取BQCV 总RNA，参照PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书反转录制备cDNA，以其为模板，以F3/B3 为引物进行PCR 扩增，反应条件：95 ℃5 min；95 ℃1 min、55 ℃1 min；72 ℃1 min，循环30 次；72 ℃10 min。扩增产物经回收后克隆至pMD18-T 载体中，构建重组质粒pMD-BQCV，提取重组质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定，并测定其浓度。

表1 BQCV LAMP 和PCR 检测引物序列Table 1 The LAMP and PCR detection primer sequences

1.5 BQCV LAMP 反应体系的建立及优化 根据DNA LAMP Kit 操作说明，利用以上引物优化BQCV LAMP 反应体系，参考 LAMP real-time Turbidimeter 仪预设参考方案中的标准，设定反应速度曲线峰值超过0.1 时判定为阳性。利用软件监控反应进程，以重组标准质粒为模板，采用不同退火温度(61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃)试验，选择最佳退火温度。

1.6 特异性试验 分别提取BQCV-JL1 株、DWV、SBV、ABPV、CBPV 基因组核酸，采用以上5 种核酸为模板，通过优化的反应体系和反应条件进行试验，待反应结束后添加SYBR Green I 5 μL(10 倍稀释)，观察阳性管内液体颜色及紫外光照射下呈现荧光情况，检测LAMP 方法的特异性。

1.7 敏感性试验 将回收的PCR 扩增产物克隆于pGEM-T 载体中，构建重组质粒pGEM-BQCV，采用紫外分光光度计测定其浓度，根据公式Y(拷贝/μL)=X(g/μL)DNA×6.02×1023/DNA 长度(bp)×660 换算为拷贝数。重组质粒pGEM-BQCV 经测序鉴定后用限制性内切酶酶切线性化，利用Riboprobe System-T7 试剂盒进行体外转录获得模板RNA，纯化后反转录制备cDNA，并将其进行倍比系列稀释后作为模板进行LAMP 扩增确定其检测的敏感性。

1.8 重复性和稳定性试验 采用同一批次提取的3个不同浓度(4×104拷贝/μL、4×105拷贝/μL、4×106拷贝/μL)BQCV DNA 作为模板进行3 次LAMP 扩增，利用LAMP real-time Turbidimeter 仪分析最大扩增速率，计算变异系数(CV)；再选取3 个不同批次提取的BQCV DNA 作为模板进行3 次LAMP 检测，计算CV 值，确定LAMP 方法的重复性和稳定性。

1.9 临床样品的检测 对从部分省份采集的40 份疑似病蜂样品(DNA 提取方法同1.4)进行常规PCR和LAMP 方法检测，并比较两种方法检出率。

2 结果

2.1 LAMP 目的片段的验证与测序分析 以BQCV的RNA 反转录制备的cDNA 为模板，采用引物F3和B3 进行PCR 扩增后经2 %琼脂糖凝胶电泳得到约200 bp 目的片段(图略)，大小与预期相符。扩增片段经测序后利用NCBI 中Blast 与GenBank 中KM255693.1、HG779865.1、JX679491.1、JX679489.1、AB746348.1、AB746347.1、JX149518.2、AB723738.1、JN379018.1 进行对比分析，结果显示同源性达100%，表明用该引物可以检测到BQCV。

2.2 LAMP 反应体系的建立及优化 经优化后BQCV LAMP 反应体系见表2，根据得出的LAMP反应体系对退火温度进行优化，结果显示63 ℃为最佳温度。

表2 BQCV LAMP 反应体系Table 2 The LAMP reaction system of BQCV

2.3 特异性试验结果 利用建立的LAMP 方法对BQCV-JL1 株、DWV、SBV、CBPV、ABPV 病毒基因组核酸进行检测，结果显示：利用软件监控显示当LAMP Turbidimeter 温度到达63 ℃时，23 min 后仅BQCV-JL1 为阳性，其它样品均为阴性，与普通PCR 检测BQCV 特异性结果一致(图1)。反应结束后加入SYBR Green I 后管内颜色情况、紫外光下产物呈现荧光情况与real-time Turbidimeter 仪检测结果一致，表明该方法具有较好的特异性。

2.4 敏感性试验结果 重组质粒pGEM-BQCV 经紫外分光光度计检测核酸含量为8.91 pg/μL，换算拷贝数为4.0×107拷贝/μL。按照Riboprobe System-T7 试剂盒说明转录合成RNA，反转录制备cDNA，将其进行倍比系列稀释，利用LAMP 进行扩增，并以real-time Turbidimeter LA-320 检测敏感性，结果显示，本实验建立的LAMP 体系检测方法最低检测浓度为4.0×102拷贝/μL，而PCR 最低检测浓度为4.0×104拷贝/μL，LAMP 检测的灵敏度是PCR 检测的100 倍。待反应结束后加入SYBR Green I 后管内颜色情况、紫外光照射下产物呈现荧光情况与real-time Turbidimeter 仪检测结果一致(图2)。表明该方法具有较高敏感性。

图1 BQCV LAMP 和PCR 特异性试验分析图Fig.1 Specific test of BQCV LAMP(A)and RT-PCR(B)

图2 BQCV LAMP 法与PCR 敏感性对比图及LAMP 可视化图Fig.2 BQCV LAMP method and the PCR sensitivity comparison chart and LAMP visualization picture

2.5 重复性和稳定性试验结果 取同一批次不同浓度和不同批次BQCV DNA 为模板进行LAMP 扩增，每个批次3 个重复，结果显示最大扩增速率的CV小于10 %(表3)，表明该方法具有较好的重复性和稳定性。

表3 BQCV 重复性和稳定性试验结果Table 3 Repeatability and stability test results for BQCV

2.6 临床样品的检测 采用建立的BQCV LAMP方法与普通PCR 同时检测40 份临床样品，结果显示，普通PCR 检出率为72.5 %(29/40)，LAMP 检出率为87.5 %(35/40)，LAMP 检出率明显高于常规PCR。表明本实验建立的LAMP 可用于BQCV 临床检测。

3 讨论

本研究利用LAMP real-time Turbidimeter LA-320仪针对BQCV 反应进程进行实时监控建立了BQCV的实时定量LAMP 方法。BQCV 核酸在63 ℃的恒温条件下反应35 min 即可判定结果，反应结束后在扩增产物中加入了SYBR Green I[8]及紫外光下，实现了LAMP 的可视化，使结果更为直观。应用建立的LAMP 法仅BQCV 可见特异性扩增，而DWV、SBV、CBPV、ABPV 均无扩增，表明该方法具有较好的特异性；由于BQCV 为RNA 病毒，在反转录制备cDNA 过程中的效率并不是100 %，将导致严重的系统误差，因此本研究先将目的片段克隆于含有体外转录的T7 或T3 启动子质粒中，并通过紫外分光光度计检测含量，确定其初始拷贝数，再通过体外转录方法获得RNA 片段，以其为模板反转录制备cDNA，倍比稀释检测其敏感性[8]，结果显示检出最低限量可达4.0×102拷贝/μL，是普通PCR 的100 倍，通过体外转录过程使得敏感性检测结果更为完善；对同一批次和不同批次样品进行重复性和稳定性试验，最大扩增速率的变异系数均小于10%，说明该方法具有较好的重复性和稳定性；对40 份不同临床样品应用常规PCR 和LAMP 法检测，LAMP法检出率为87.5 %，而普通PCR 检出率为72.5 %，表明该方法准确度高于常规PCR，能有效减少假阴性出现。

LAMP 法只需恒温环境便可对靶序列进行扩增，省时且成本低，较PCR 方法更为快捷和准确，为快速检测BQCV 提供了一定的理论依据。本研究建立了BQCV LAMP 的检测方法，在较短时间便可完成检测，并且检出最低限量比普通PCR 高100 倍，在检验准确度与普通PCR 结果一致的情况下，操作更为简便，为快速检测BQCV 提供了一种方法。

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