ISG15 蛋白促进猪源牛病毒性腹泻病毒2 型对I 型IFN 表达抑制的研究

陶 洁，廖金虎，张 倩，张信军，朱国强

(1.扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009；3.上海市农业科学院 畜牧兽医研究所，上海 201106)

猪源牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)的流行日益广泛，在国内外猪群中的感染现状已相当严重，成为一个不容忽视的问题[1]。通常，猪感染BVDV 不表现出临床症状，或表现出类似于猪瘟症状，因此猪BVDV 感染和CSFV 感染常被混淆[2]。这不仅给猪瘟检疫带来了困难，也给BVDV 防控添加了新的难题。BVDV 感染动物可以引起免疫抑制，以此逃避宿主先天免疫功能，并在宿主机体中呈持续性感染[3]。研究证实，只有非致细胞病变(NCP)型BVDV 实验性感染动物才能诱发持续性感染[4]。目前，关于BVDV 逃避机体先天免疫的机制尚不清楚，而了解这一机制有助于制定更全面的防控措施，从而更好的预防和控制BVDV 在猪群和牛群中的感染。

泛素样蛋白ISG15 是干扰素α/β(IFN-α/β)信号的一个负调控因子，该蛋白可以抑制多种DNA 病毒和RNA 病毒的增殖，属于宿主的天然免疫蛋白[5]。因此，阐明ISG15 和猪源BVDV-2 之间的相互作用，不仅可以更清楚的了解ISG15 抗病毒机制，也可以为深入研究猪源BVDV-2 逃避细胞先天免疫作用的机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞、多抗及质粒 猪源BVDV-2 SH-28 株由本实验室分离鉴定；牛肾细胞系(MDBK)和质粒pEC129[6]由美国宾夕法尼亚大学Dr.Leonard教授赠予；鼠抗ISG15 多克隆抗体由本实验室制备；E.coli DH5α 由本实验室保存。

1.2 主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、r Taq DNA 聚合酶、DL2000 Marker 均购自TaKaRa公司；Donor Equine Serum(HS)购自Hyclone(Thermo scientific)；G418 Sulfate 购自Sigma-Aldrich 公司；TRIzol Reagent、Lipofectamine LTX and PlusTMReagent、SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR购自Invitrogen 公司；FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)购自Roche 公司；poly I:C 购自Sigma公司。

1.3 引物设计 根据GenBank 中登录的牛IFN 刺激因子ISG15 基因序列(AF069133)设计一对引物，并在上下游引物末端分别引入NheⅠ和Bam HⅠ酶切位点。引物由上海基康生物技术有限公司合成(表1)。

内参基因GAPDH、IFN-α、IFN-β 和ISG15 基因荧光定量PCR 引物由上海Invitrogen 公司设计并合成(表1)。

表1 各基因的PCR 引物Table 1 PCR primers for amplification of the genes

1.4 ISG15 基因的扩增及重组真核表达质粒的构建以人源IFN-α-2A 刺激MDBK 细胞后[7]，提取细胞总RNA 并反转录制备cDNA，采用引物ISG15-1/2 PCR 扩增ISG15 基因。以NheⅠ和Bam HⅠ双酶切后克隆于真核表达载体pEC129 中，构建重组真核表达质粒pEC-ISG15，并进行测序鉴定。

1.5 稳定表达ISG15 蛋白细胞系的构建与筛选将G418 设定10 个浓度梯度，以100 μg/mL 为递增值，分别为100 μg/mL～1 000 μg/mL，每组设3 个平行样。连续培养10 d～14 d，待MDBK 细胞全部死亡时G418 的最低浓度为MDBK 细胞最佳筛选浓度[8]。筛选稳定细胞系时使用的浓度比最佳筛选浓度高一个稀释度，维持液浓度为最佳筛选浓度的一半。

参照Lipofectamine LTX and PlusTMReagent 说明书，将pEC129-ISG15 转染MDBK 细胞；培养6 h后，将细胞上清液换成含有10 % HS 的DMEM 完全培养液。同时设置空质粒对照。参照文献[9]方法，将转染24 h 后的MDBK 细胞传代至新的6 孔细胞板中(约2×104个/孔)。待细胞贴壁后，将培养液更换为含最佳工作浓度G418 的完全培养液进行抗性筛选；每2 d～3 d 更换一次培养基，直至阴性对照组中细胞全部死亡；将转染质粒细胞孔内筛选培养基更换为维持培养基，即调整G418 终浓度为300 μg/mL，继续培养细胞，直至6 孔板中长出单克隆细胞团；将其进行胰酶消化传代，以含300 μg/mL G418 培养液中继续培养，并逐渐扩大培养，形成稳定的传代细胞系，将其命名为E53。

1.6 稳定表达ISG15 蛋白细胞系的鉴定

1.6.1 间接免疫荧光(IFA)鉴定 将第10 代建立的细胞系E53 铺于24 孔培养板，以鼠抗ISG15 多克隆血清(1∶2 500)为一抗，FITC 标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000)为二抗进行ISG15 蛋白表达的IFA 鉴定[10]。

1.6.2 Western blot 鉴定 将第10 代建立的细胞系E53 细胞裂解后，进行收集细胞总蛋白，进行SDS-PAGE 电泳，转膜后以鼠抗ISG15 多克隆抗体(1∶2 500)为一抗，HRP 标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000)为二抗，进行ISG15 蛋白表达的western blot 鉴定。

1.7 病毒增长曲线的绘制 将病毒(1 MOI)分别感染单层MDBK 细胞和E53 细胞。在感染后不同时间点分别收集细胞上清液，并分别测定其TCID50，绘制病毒在两种细胞中的病毒滴度增长曲线。

1.8 I 型IFN 的荧光定量PCR 检测 弃去细胞上清，加入1 mL 细胞裂解液，4 ℃作用30 min，收集单层细胞，12 000 r/min 离心10 min；吸取400 μL上清液，参照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 说明书，提取细胞总RNA 并反转录。将cDNA 稀释3 倍后作为模板，按FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)说明书，采用SYBR Green I 法进行荧光定量PCR 扩增，以GAPDH 基因为内参，检测各样品中I 型IFN 的相对表达量。同时设阴性对照，检测数据利用2-△△CT方法进行处理[11]。采用SPASS13.0 软件进行差异显著性分析。

1.9 ISG15 对病毒诱导I 型IFN 表达影响的检测取等量的E53 细胞和MDBK 细胞分别铺于6 孔细胞板中，24 h 后各孔内加入终浓度为50 μg/mL 的poly I:C；作用6 h 后，各孔加入1 MOI BVDV-2；吸附1 h 后，弃去细胞上清，分别加入DMEM 维持液继续培养；24 h 后，收集细胞，利用荧光定量PCR 检测细胞内IFN-α 和IFN-β 的表达情况。

2 结果

2.1 ISG15 基因的扩增及重组真核表达质粒的鉴定利用ISG15-1/2 引物PCR 扩增ISG15 基因，结果显示，扩增片段约为500 bp，与预期相符(图1)。将PCR 扩增产物经双酶切后克隆至真核表达载体pEC129 中，经鉴定，重组质粒pEC-ISG15 构建正确。

图1 ISG15 的PCR 扩增Fig.1 Amplification of ISG15 gene by PCR

2.2 稳定表达ISG15 蛋白细胞系的鉴定 经筛选，MDBK 细胞的最佳筛选浓度为600 μg/mL G418，获得单克隆细胞团后，即利用300 μg/mL G418 的维持液进行扩大培养。

以ISG15 多克隆抗体为一抗，对第10 代稳定细胞系E53 进行IFA 和western blot 检测，同时设MDBK 细胞作为阴性对照。结果显示，稳定细胞系E53能够稳定表达ISG15 蛋白(图2)。

图2 过表达ISG15 细胞系E53 的IFA(A)和western blot(B)的鉴定Fig.2 Idetification of the ISG15 over-expressed cell line E53 by IFA(A)and western blot(B)

2.3 ISG15 蛋白对BVDV-2 复制的影响 将BVDV-2以1 MOI 的剂量分别感染E53 和MDBK 细胞，于不同时间点分别测定其病毒滴度，并绘制病毒增长曲线。结果表明，病毒在MDBK 细胞中滴度呈逐渐递增趋势，60 h 时病毒滴度达到峰值(TCID50为10-6.5)；在E53 细胞中，病毒滴度虽有所增长，但变化趋势不大，60 h 时TCID50为10-3.8(图3)。两者差异显著(p<0.05)，表明过表达ISG15 蛋白对BVDV-2的复制具有明显抑制作用。

图3 ISG15 蛋白对猪源BVDV-2 复制的影响Fig.3 The effect of ISG15 protein on the replication of BVDV-2

2.4 BVDV-2 感染对ISG15 基因表达的影响 将BVDV-2 以1 MOI 的剂量感染E53 细胞同时设未感染的E53 细胞空白对照；分别在不同时间点收集细胞并提取其总RNA，利用荧光定量PCR 检测各时间点细胞内ISG15 基因表达情况；结果显示，与空白对照相比，病毒感染的E53 细胞中ISG15 基因表达量明显高于空白对照E53 细胞，48 h 时ISG15 基因的表达差异显著(p<0.05)，表明BVDV-2 感染细胞后能够促进ISG15 的表达(图4)。

图4 猪源BVDV-2 感染细胞对ISG15 基因表达的影响Fig.4 The effect of pig BVDV-2 infection on the relative mRNA transcription levels of ISG15 gene

2.5 ISG15 基因对BVDV-2 诱导I 型IFN 表达的影响 病毒感染MDBK 和E53 细胞，结果表明均能够抑制由poly I:C 诱导产生的IFN-α 和IFN-β。MDBK细胞中，IFN-α 和IFN-β 表达量分别下降约2.49 和3.31 倍；而E53 细胞中，IFN-α 和IFN-β 分别下降约6.29 倍和9.71 倍，表明ISG15 蛋白的存在能够提高BVDV-2 抑制I 型IFN 表达的能力(图5)。

图5 ISG15 促进BVDV-2 抑制I 型IFN 表达Fig.5 The role of ISG15 on BVDV-2 inhibited IFN-I

3 讨论

研究报道，ISG15 在宿主天然免疫反应中发挥重要作用，它能够抑制多种病毒的复制，从而发挥抗病毒功能[12]。因此，研究ISG15 蛋白和猪源BVDV-2 之间相互作用关系，不仅有助于了解ISG15 的抗病毒机制，也为猪源BVDV-2 逃避细胞先天免疫机制的研究奠定基础，从而为BVDV 持续性感染机制的研究提供依据，有助于制定更全面的BVDV 防控措施及BVDV 新型疫苗的研制。

SH-28 株是由本实验室分离鉴定的一株NCP 型猪源BVDV-2 分离株，以此为基点，结合以前所做的基础工作，本实验展开猪源BVDV-2 和ISG15 相互作用研究。结果显示BVDV-2 SH-28 株在E53 细胞系中增殖速度明显下降，表明过量表达ISG15 能够抑制猪源BVDV-2 复制。此外，感染BVDV-2 可以促进细胞内ISG15 的表达，这可能是由于BVDV-2感染细胞，激活了细胞的先天免疫，使ISG15 表达量升高，从而发挥其抗病毒功能。此外，我们还研究了ISG15 蛋白对猪源BVDV-2 抑制I 型IFN 表达的影响，将SH-28 株分别感染经poly I:C 处理的MDBK 细胞和E53 细胞，利用荧光定量PCR 检测不同细胞内I 型IFN 的表达情况，结果表明经SH-28株感染后，E53 细胞内I 型IFN 表达下降的倍数高于MDBK 细胞内I 型IFN 下降的倍数，表明ISG15能够促进猪源BVDV-2 抑制I 型IFN 的表达，为探索BVDV-2 的免疫抑制机制提供了线索。

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