新型鸭呼肠孤病毒σC 蛋白间接ELISA 检测方法的建立

王锦祥，程晓霞，陈少莺*，陈仕龙，林锋强，王 劭

(1.福建省农业科学院 畜牧兽医研究所，福建 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013)

鸭出血性坏死性肝炎是由新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)引起鸭的一种新发传染病，其特征是肝脏不规则坏死和出血、心肌出血、脾脏肿大斑块状坏死、肾脏和法氏囊出血。NDRV主要感染雏鸭，感染鸭死亡率高，日龄愈小并发感染时其发病率、死亡率愈高，给养鸭业造成较大的经济损失。自陈少莺等首次将鸭出血性坏死性肝炎的病原鉴定为NDRV 后[1]，在我国福建[2]、广东[3]和浙江[4]等地的鸭群中相继有该病发生的报道，疫区有逐年扩大的趋势。

目前，已报道的NDRV 实验室检测方法尚未见ELISA 方法报道。ELISA 是一种简便、快速、敏感且适用于大批量样品检测的血清学方法[5]。本研究以原核表达的NDRV 外衣壳蛋白σC 为检测抗原，建立了检测NDRV 抗体的间接ELISA 方法，为NDRV 抗体检测试剂盒的研制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、血清和临床样品 重组菌pET-NDRVσC/BL21 由本实验室构建并保存；NDRV 阳性和阴性血清、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭肝炎病毒(DHV)、番鸭细小病毒(MPV)和番鸭源鹅细小病毒(MD-GPV)阳性血清均由本实验室保存；NDRV 阴性血清为采自浙江、福建和广东等地区经NDRV 全病毒间接ELISA 检测为阴性的鸭血清；待检血清样品采自浙江、福建、广东等不同地区的212 份疑似NDRV 感染鸭。

1.2 主要试剂 辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG(IgG-HRP)购自美国KPL 公司；SDS-PAGE 凝胶试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；镍离子亲和纯化柱购自GE 公司。

1.3 重组蛋白的表达及纯化 将重组菌pETNDRV-σC/BL21 进行诱导表达，按照His Trap FF 蛋白纯化步骤纯化σC 重组蛋白，通过SDS-PAGE 及western blot 对重组蛋白进行鉴定。

1.4 间接ELISA 方法的建立 将重组蛋白经pH9.6的碳酸盐缓冲液倍比稀释(50 μg/mL～3.12 μg/mL)后包被96 孔ELISA 板，每孔100 μL，4 ℃过夜。以NDRV 阳性血清和阴性血清(1∶20～1∶320)倍比稀释后为一抗，每孔100 μL，37 ℃作用90 min。以羊抗鸭IgG-HRP(1∶400)为二抗，37 ℃作用60 min。加入底物，37 ℃作用3 min～15 min，2 mol/L H2SO4终止反应，测定样品的OD490nm值。上述操作重复3次。以阳性血清OD490nm值大于1.0，P/N 值(阳性血清OD490nm/阴性血清OD490nm)最大时的反应条件为最佳工作条件。

1.5 间接ELISA 判断标准的确定 参照文献[6]的方法，将164 份NDRV 阴性血清在最佳工作条件下进行间接ELISA 测定。计算每份血清的S/P 值及平均值和标准方差(SD)确定阴阳性临界值S/P=(样品OD490nm值-阴性对照OD490nm值)/(阳性对照OD490nm值-阴性对照OD490nm值)

1.6 阻断试验 将阳性血清按最佳稀释度进行稀释，加入等体积最适稀释度的重组抗原，于37 ℃作用1 h，将上述混合液加入已包被抗原的酶标板，同时设阳、阴性血清对照组，进行ELISA 反应，测定其OD490nm。按(N-P)/N=(未阻断孔OD490nm值-阻断孔OD490nm值)/(未阻断孔OD490nm值)的公式计算，若结果大于0.5，则判断为阻断阳性。

1.7 特异性试验 按照建立的ELISA 方法，对本实验室保存的MDRV、DHV、MPV 和MD-GPV 的阳性血清进行检测，每份血清设3 个重复，同时设置NDRV 阳性和阴性血清对照，验证建立的ELISA方法的特异性。

1.8 重复性试验 采用同一时间和不同时间包被的ELISA 反应板，选取NDRV 抗体效价不同的8 份血清，按建立的间接ELISA 方法进行批内和批间重复性试验。每份血清重复检测3 次，评价该方法的重复性。

1.9 符合性试验 应用NDRV 全病毒间接ELISA和建立的σC 蛋白间接ELISA 方法对80 份疑似鸭血清样品进行检测，统计两者的符合率。

1.10 临床血清样品的检测 应用建立的σC 蛋白间接ELISA 方法，检测来自浙江、福建和广东等不同地区共132 份疑似NDRV 感染的血清样品，计算样品的阳性率。

2 结果

2.1 重组蛋白的表达及鉴定 重组菌pET-NDRVσC/BL21 经IPTG 诱导后对重组蛋白进行SDS-PAGE检测，结果显示重组蛋白获得表达，其分子量约为40 ku，与预期结果相符，并且重组蛋白以包涵体形式存在。Western blot 结果表明，重组蛋白与NDRV阳性血清发生特异性反应，具有良好的反应原性(图1)。

图1 NDRV σC 纯化蛋白的SDS-PAGE 和western blot 分析Fig.1 SDS-PAGE and western blot analysis of the purified NDRV σC protein

2.2 间接ELISA 反应条件的确定 对间接ELISA反应条件进行优化，结果见表1。

表1 间接ELISA 检测方法的反应条件优化结果Table 1 The optimized conditions of the indirect ELISA

2.3 间接ELISA 判定标准的确定 应用优化的间接ELISA 方法，对164 份NDRV 阴性血清样品进行检测，经计算为0.0564，SD 为0.0381。确定临界值为0.171，即OD490nm大于(等于)0.171判定为阳性，小于0.171 则判定为阴性(图2)。

图2 阴性血清S/P 值分布图Fig.2 Frequency distribution of S/P value of negative serum

2.4 阻断试验 将阳性血清与重组抗原等体积混合后加入已包被抗原的ELISA 板进行阻断试验，结果显示，经重组蛋白阻断的阳性血清OD490nm值比未被阻断的对照阳性血清明显降低，阻断后OD490nm值平均为0.338，对照阳性血清的OD490nm值平均为1.560，计算阻断率为0.783，大于0.5，判定为阻断试验阳性，表明重组抗原可以阻断阳性血清与重组蛋白的反应。

2.5 特异性试验 对MDRV、DHV、MPV 和MDGPV 4 份阳性血清进行检测，结果表明重组蛋白与这4 种鸭病原的阳性血清均无交叉反应，表明该检测方法具有较好的特异性。

2.6 重复性试验 采用同一时间和不同时间包被的ELISA 板，对NDRV 抗体效价不同的8 份血清进行检测，结果显示，批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%，表明该方法具有良好的重复性(表2)。

表2 间接ELISA 重复性试验Table 2 Repeatability assay for indirect ELISA

2.7 符合性试验 应用NDRV 全病毒间接ELISA和建立的σC 蛋白间接ELISA 方法对80 份疑似鸭血清样品进行检测。结果显示NDRV 全病毒间接ELISA 的阳性检出率为41.25 %(33/80)，阴性检出率为58.75 %(47/80)。本研究建立的σC 蛋白间接ELISA 方法阳性检出率为35 %(28/80)，两者符合率为88.75 %(表3)。

表3 σC 蛋白间接ELISA 和NDRV 全病毒间接ELISA方法的符合性试验Table 3 Comparison of the agreement between σC-ELISA and NDRV-ELISA

2.8 临床样品的检测 应用建立的σC 蛋白间接ELISA 方法对浙江、福建、广东等不同地区的132份疑似感染鸭血清样品进行检测，结果显示检出阳性样品57 份，阳性率为43.18 %(57/132)。

3 讨论

σC 蛋白是禽源呼肠孤病毒(ARV)的重要结构蛋白。在病毒感染过程中，σC 蛋白被活化，形成同源三聚体，与易感细胞表面的受体结合，促使病毒侵入易感细胞，是病毒的重要致病因子。此外，σC蛋白还能诱导机体产生保护性中和抗体[7-9]。研究表明，杆状病毒表达的ARV[10]和MDRV[11]的σC 蛋白能够有效地诱导实验动物产生保护性抗体，表明σC 蛋白是一种保护性抗原。耿宏伟等利用E.coli 系统表达出具有良好反应原性的MDRV σC 蛋白，并基于该蛋白建立了间接ELISA 方法[12]。本实验也选择E.coli 系统表达NDRV σC 蛋白。经western blot鉴定表明，重组蛋白具有良好的反应原性。因此，选择E.coli 表达的σC 蛋白作为抗原能够满足建立检测NDRV 抗体间接ELISA 方法的要求。

目前，国内外尚未见利用NDRV 重组σC 蛋白作为包被抗原建立间接ELISA 方法的报道。本实验利用原核表达系统表达了NDRV σC 蛋白，并采用纯化的蛋白作为包被抗原，建立了检测NDRV 抗体的间接ELISA 方法，并对反应条件进行了优化。同时试验表明其具有良好的特异性和重复性。通过对浙江、福建和广东3 省采集的132 份疑似血清样品进行检测阳性率为43.18 %。因此，采用该方法用于检测大批量血清样品具有较高的应用价值，可以广泛应用于σC 蛋白抗体的流行病学调查，同时也为研制检测NDRV 抗体的间接ELISA 试剂盒奠定了基础。

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