脑出血患者血清细胞纤维连接蛋白的测定与临床意义

王健安，黄成军

(1.广西壮族自治区南溪山医院急诊科，广西 桂林 541002； 2.桂林市第三人民医院肝病科，广西 桂林 541002)



脑出血患者血清细胞纤维连接蛋白的测定与临床意义

王健安1，黄成军2※

(1.广西壮族自治区南溪山医院急诊科，广西 桂林 541002； 2.桂林市第三人民医院肝病科，广西 桂林 541002)

摘要：目的探讨脑出血患者血清细胞纤维连接蛋白(cFN)的表达水平与脑出血的关系。方法选择2012 年4~9月广西壮族自治区南溪山医院收治的脑出血患者25例作为脑出血组,同期选择健康体检者25例作为健康对照组,应用免疫印迹法(Western blot)和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测脑出血患者入院后1、4、7 d的血清cFN表达水平，同时对应检测健康对照组血清cFN表达水平。结果Western blot检测结果显示，cFN在脑出血患者的表达水平显著高于健康对照组；ELISA检测结果显示，脑出血组患者1、4、7 d血清cFN水平分别为(238±69)、(448±84)、(280±84) μg/L，对照组1、4、7 d血清cFN水平分别为(138±30)、(141±40)、(139±15) μg/L，两组不同时点间比较差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析结果显示cFN表达水平与血肿体积的大小呈正相关(P<0.05)。结论脑出血患者血清cFN表达水平升高, cFN表达水平可能与脑出血患者预后有关，但尚需临床大样本的试验研究。

关键词：脑出血；细胞纤维连接蛋白；预后

脑出血是全世界病死率和致残率极高的常见病之一，其原因往往与脑动脉粥样硬化、高血压等有关，至今仍缺乏有效的治疗方法,约40%的脑出血患者在发病1个月内死亡，而存活者约66%会致残[1]。近来在研究发现细胞纤维连接蛋白(cellular fibronectin,cFN)与心脑血管疾病有关，纤维连接蛋白是血管内皮的一种糖蛋白，它的水平升高可以损伤血管内皮，容易诱发脑出血。本研究采用免疫印迹法(Western blot)和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测受试者血清cFN表达水平，揭示cFN与脑出血的关系，为脑出血的诊断、治疗、预后提供有利线索。

1资料与方法

1.1一般资料选择2012 年4~9月广西壮族自治区南溪山医院收治的脑出血患者25例作为脑出血组,男15例、女10例, 年龄45～79岁，平均(62±11)岁。患者于入院1、4、7 d行头颅CT扫描，然后根据多田公式：出血量(mL)=Π/6×长(cm)×宽(cm)×高(cm)，计算脑血肿体积。选择同期健康体检者25例作为健康对照组，男17例、女8例,年龄48～75岁，平均(58±8)岁。两组受试者性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有均衡性。脑出血组患者均排除既往脑血管性疾病、使用抗凝剂、严重感染、严重心肝肾疾病及严重头部外伤史。样本采集时患者及健康人均知情同意，在自愿的条件下签署知情同意书。

1.2主要仪器4 ℃冰箱(青岛海尔公司)，5180R型高速低温离心机(德国Eppendorf公司)，离心管(美国Corning公司)，雪花制冰机(日本SANYO公司)，蛋白电泳仪、电转仪及附件、酶标仪(美国Bio-Rad公司)，Odyssey红外激光成像系统(美国Odyssey公司)。

1.3主要试剂十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳仪，凝胶(SDS-PAGE)配制试剂盒(碧云天公司)，蛋白marker(加拿大Fermentas公司)，滤纸(英国whatman公司)，聚偏二氟乙烯膜(美国Millipore公司)，细胞纤维连接蛋白抗体(美国santa crus公司)，人细胞纤维连接蛋白ELISA试剂盒(美国Cusabio公司)，IRDye 680标记羊抗鼠IgG二抗(美国LI-COR公司)。

1.4试验方法

1.4.1Western blot配制8% SDS-PAGE，将凝胶固定于电泳装置上，各加入电泳缓冲液；血清样本稀释后，与上样缓冲液混匀，于沸水中煮5 min，短暂离心后，按照实验设计的顺序依次将样品小心加入上样孔内；往电泳槽中加入电泳缓冲液，然后按设定程序80 V/30 min，120 V/90 min电泳；电泳结束后，按恒流250 mA 1.5 h将凝胶上的蛋白质转到聚偏二氟乙烯膜上；之后进行封闭，将膜蛋白面朝下放于一抗稀释液面上，4 ℃摇床避光孵育过夜；用吸水纸将聚偏二氟乙烯膜多余的液体吸干，将膜蛋白面朝下放于二抗稀释液上，室温下避光孵育2 h；膜清洗后，用Odyssey红外激光成像系统进行扫描。

1.4.2ELISA标准品按照说明书分别按照1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、0 μg/L的浓度作标准曲线；各组血清样本用样本稀释液进行1∶500倍；然后将标准品与待测血清样本加于酶标板孔底部，轻轻晃动，酶标板加上覆膜，37 ℃孵育120 min；移去酶标板上的液体，甩干，然后每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，37 ℃孵育60 min；移去孔内液体，甩干，洗板3次，每孔加200 μL洗涤液，每次浸泡2 min，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，37 ℃孵育60 min；依次每孔加入底物溶液90 μL，37 ℃避光显色；15 min内于波长450 nm酶标仪上测量各孔的光密度(OD值)。

2结果

2.1Western blot结果Western blot结果显示,脑出血患者的cFN表达水平显著高于对照组，脑出血组患者血清cFN在1 d的表达水平升高，4 d后升高明显、7 d后表达水平逐渐下降；健康对照组在1、4、7 d的血清cFN表达水平均较脑出血组低，且各个时期均无变化。见图1。

图1　脑出血组和对照组不同时点间细胞纤维连接蛋白的表达

2.2ELISA结果ELISA检测显示，两组间4 d时血清cFN水平均升高，7 d时水平均下降，两组不同时点间血清cFN水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，而在健康对照组1、4、7 d的表达水平显著低于脑出血组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

组别例数1d4d7d脑出血组25238±69448±84280±84健康对照组25138±30141±40139±15 组间F=47.01 P=0.001 不同时点间 F=53.86 P=0.001 组间·不同时点间F=50.10 P=0.001

cFN：细胞纤维连接蛋白

2.3脑出血患者血清cFN与血肿量的关系对脑出血患者血清中cFN水平与血肿量作散点图，结果显示，1、4、7 d的图形分布趋势呈直线趋势，其绝对值呈显著正相关(r1=0.961,P1=0.001；r4=0.962,P4=0.001；r7=0.937,P7=0.001)，见图2。

cFN:细胞纤维连接蛋白图2　血清cFN与血肿量的关系

3讨论

脑出血是指原发性脑动脉、脑静脉或毛细血管破裂而非外伤等所致的脑实质出血，发病率占脑卒中的10%～30%[1]。近年来发病年龄有愈来愈年轻的趋势。脑出血是常见的急危重症疾病，与缺血性梗死相比，其致残率及病死率均较高，给社会和家庭带来沉重负担。

随着研究的不断深入，人们对于脑出血病理损伤机制、治疗、预后等认识日益深入。研究表明，脑出血患者导致病情加重的原因除血肿本身的占位性损害外，尚与很多因素有关，如脑血肿周围组织局部脑血流下降、脑血肿周围组织水肿、血脑屏障受损、血液分解产物释放多种生物活性物质[2-5]。cFN是纤维连接蛋白的一员，一组具有多种生物活性的大分子糖蛋白，主要由肝细胞、血管内皮细胞和纤维母细胞等合成，对于血小板黏附有着重要作用[6]。近年来，cFN在脑血管疾病中的作用也日益受到重视，但多数研究都集中在它们与脑缺血的关系上，其与脑出血的关系研究甚少。

本研究通过Western blot证实了cFN在脑出血患者中的表达水平显著高于对照组，两组间4 d时血清cFN水平均升高，7 d时水平均下降，两组不同时点间血清cFN水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，而在健康对照组1 、4、7 d的表达水平显著低于脑出血组，差异有统计学意义(P<0.05)。此外，利用ELISA技术测定了脑出血组及健康对照组血清cFN水平，发现脑出血患者血清中cFN显著升高，与Western blot结果相吻合。Castellanos等[7-8]研究也发现，急性缺血性卒中溶栓治疗后继发出血的患者cFn水平明显升高，出血越严重，cFN的水平也越高，cFN≥3600 μg/L时，预测出血发生的准确性为100%。Silva等[9]分别检测183例脑出血患者不同时间段血浆白细胞介素6、cFn等水平，发现在后继出现血肿增大和预后较差的患者中，血浆细胞因子或炎性介质的水平明显升高，而且升高的值同血肿的大小呈正相关。至于脑出血患者血清中cFN明显升高的具体机制尚未明确，其可能为脑血管疾病患者动脉血管状况均不同程度存在粥样硬化以及粥样斑块的溃疡，这些都可导致血管内皮细胞和纤维母细胞合成cFn增多，血清中cFn水平升高。cFN作为一个血小板整合素的配体参与血小板的黏附和聚集反应，使之黏附、聚集于内膜上，形成附壁血栓，从而加速止血[10]。

本研究通过探讨cFN与脑出血的关系还发现脑出血的血肿体积越大，cFN的值也就越高，患者血清cFN水平与脑出血血肿体积呈正相关。其可能的原因是血肿压迫周边组织，缺血缺氧加重刺激细胞分泌释放更多cFN，以保护机体。这也提示定期测定患者血清cFN水平，有助于判断脑出血患者病情严重程度。但本研究只是初步了解脑出血患者血清cFN情况，至于cFN与脑出血患者的预后关系，尚需进一步的试验研究。

参考文献

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Determination of Plasma Cellular Fibronectin Concentration in Patients with Intracerebral Hemorrhage and Its Clinical Significance

WANGJian-an1,HUANGCheng-jun2.

(1.DepartmentofEmergency,NanxishanHospitalintheGuangxiZhuangAutonomousRegion,Guilin541000,China; 2.DepartmentofHepatopathy,GuilinCityThirdPeople′sHospital,Guilin541002,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate serum cellular fibronectin(cFN) levels in patients with intracerebral hemorrhage and its correlation with cerebral hemorrhage.MethodsA total of 25 cases of cerebral hemorrhage from Guanyang County People′s Hospital from Apr. 2012 to Sep. 2012 were included as the hemorrhage group, and another 25 healthy objects were included as control group.cFN expression level in serum samples of both groups at 1,4,7 d after the onset of stroke was measured by Western blot and enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsWestern blot analysis showed that the cFN expression level in the hemorrhage group was significantly higher than the control group.The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) indicated that levels of serum cFN were significant higher in the hemorrhage group at each time point after onset than those in the control group.The highest level of serum cFN was found at 4 days. The levels of serum cFN in hemorrhage group at 1,4,7 d after onset were:(238±69)，(448±84)，(280±84) μg/L;while in the control group were:(138±30) ，(141±40)，(139±15) μg/L,the differences between the two groups at each time point were statistically significant(P<0.05).Correlation analysis showed cFN level was positively correlated with the brain edema volume(P<0.05).ConclusionThe serum cFN expression level is higher in hemorrhage patients, and may be associated with the prognosis of the patients,though further validation by large clinical samples study is still needed.

Key words:Intracerebral hemorrhage; Cellular fibronectin; Prognosis

收稿日期：2014-01-26修回日期：2014-07-16编辑：伊姗

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.01.048

中图分类号：R743.3

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)01-0121-03