正性脾自体移植对DEN诱发大鼠肝癌的治疗作用

韩殿冰，梁　玲，张朝阳，赵　刚，冯大猛　(.汝州市第四人民医院肝胆外科，河南 汝州 467500；.临沂市妇幼保健院药剂科，山东 临沂 76000;.汝州市第一人民医院普通外科，河南 汝州 467500)



正性脾自体移植对DEN诱发大鼠肝癌的治疗作用

韩殿冰1，梁玲2，张朝阳3，赵刚3，冯大猛3(1.汝州市第四人民医院肝胆外科，河南 汝州 467500；2.临沂市妇幼保健院药剂科，山东 临沂 276000;3.汝州市第一人民医院普通外科，河南 汝州 467500)

[摘要]目的探讨正性脾自体移植对DEN诱发大鼠肝癌的治疗作用。方法40只健康大鼠平均随机分为A、B 2组，全部行脾切除，切除的脾冻存于液氮中；以DEN液喂食切除脾的大鼠以诱导肝癌；12周后诱癌成功的A组大鼠行自体脾移植，诱癌成功的B组假手术作为对照。结果A组大鼠术后生存期显著高于B组大鼠，但A组大鼠死亡时移植脾组织尚未恢复到正常形态结构。结论正性脾自体移植对DEN诱发的大鼠肝癌具有治疗作用。

[关键词]脾；移植；肝癌；治疗

脾是人体最大的免疫器官，具有重要的免疫功能和抗癌作用[1-2]。脾的抗癌作用表现为双时相性，在癌症晚期可能促进癌症的进展，在癌症早期脾尚有一定的抗癌作用[3-4]，那么，在更早期，即尚未发生癌症的时候，脾的抗癌作用如何呢？目前尚未见此类报道。为叙述方便，在此，我们将无癌症时的健康脾称为“正性脾”，癌症晚期的脾脏称为“负性脾”。基于正性脾的抗癌作用及脾与肝的密切关系，本研究试图探讨正性脾自体移植对DEN诱发的大鼠肝癌的治疗作用。现报告如下。

1材料与方法

1.1实验动物及分组

5周龄健康雄性SD大鼠40只，体质量145～160 g，随机分为2组，每组20只。A组为实验组，B组为对照组。2组大鼠全部行脾切除，切除的脾编号后放在液氮中保存[5-6]。

1.2大鼠肝癌模型的建立

脾切除后大鼠的编号保持清晰可辨，必要时以记号笔重写以免造成混乱。术后7 d 用0.01%二乙基亚硝胺(DEN，购于北京百灵威科技有限公司)的饮用水让大鼠自由饮用诱癌。因DEN液易挥发，饮水瓶应避光，每2 d更换1次新配的DEN液以保持浓度一致。

1.3自体脾移植

诱癌12周后全部大鼠开腹探查，对疑有肝癌的部位取肝组织备病理学检查，同时对A组行大网膜内自体脾组织移植。B组假手术作为对照，病理证实未发现肝癌者弃之不用。术后所有大鼠开始自由饮用不含DEN液的饮用水。

脾移植方法：取上腹部横切口，探查肝。将12周前置于液氮中保存的脾解冻后，去除表面的包膜，将其剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小碎片，在大网膜上用3-0的丝线做1个荷包，将脾组织包埋移植于大网膜的荷包内。假手术组仅用3-0的丝线荷包缝合大网膜，腹部切口丝线缝合。注意脾组织移植时应做到自体移植。

1.4观察指标

病理变化：大鼠自然死亡后即刻打开腹腔暴露肝脏，疑为肝癌的部位取部分肝组织，同时在大网膜内切取部分脾组织以备病理检查。所有切取的肝脾组织均置于10%福尔马林液中固定，石蜡包埋，切片，HE染色后观察病理学变化。所有大鼠最后死亡时抽取心内血液2 mL留待检查肝功能及AFP。HITACH717全自动生化分析仪进行肝功能测定，ELISA法测定血清AFP水平。术后生存时间是指自体脾移植手术(或假手术)后至自然死亡的时间。

1.5数据处理

2结果

2.1诱发肝癌的情况

诱癌12周末A组存活17只，病理证实有肝癌15只。B组存活18只，病理证实有肝癌15只。诱癌成功的30只大鼠的肝癌结节散在分布于肝表面，在肝不同部位可见同时存在的癌结节。这些癌结节直径1～3 mm，常有10～20个聚集成团，如芝麻粒样呈灰白色，肉眼观察无明显肝硬化表现(图1a)。这些癌肿镜下呈典型的肝细胞癌表现，肝小叶结构消失，肝细胞异形性明显，细胞核深染，大小不等，核仁明显(图1b)。

2.2移植脾的情况

液氮中保存12周的脾行病理检查发现无明显坏死区，脾组织结构清晰，红髓、白髓、边缘带分界清楚，可见巨噬细胞，脾组织结构基本正常(图1c)。脾移植后48 d，脾组织的中心区以片状坏死为主，红、白髓结构不清，在移植脾组织的周边部位残存有少量的组织细胞及散在淋巴细胞(图1d)。

2.3肝功能及AFP的情况

肝功能及AFP的情况见表1，A组血清AFP明显低于B组，2组比较P<0.05，差异有统计学意义。

组别ALTASTALPAFPA组69.32±13.3483.25±16.74329.28±30.268.74±1.21*B组78.65±11.2189.57±18.21358.74±31.3613.25±2.06P值0.580.680.650.01

*：与B组比较，P<0.05

2.4术后生存情况

诱癌成功的30只大鼠无手术死亡，术后生存期A组24～48 d，平均(35.8±6.7)d，B组13～26 d，平均(18.5±3.6)d，2组大鼠术后生存期有显著差异(P<0.05)。死亡原因均为肝癌破裂出血，死亡后剖腹发现2组大鼠癌肿均明显变大。

a:诱癌12周后，肉眼见肝癌结节散在分布于肝脏的表面，如芝麻粒大小呈灰白色;b:诱癌12周后，病理切片见肝小叶结构消失，细胞异形性明显(HE×1 000);c:保存12周的脾组织结构基本正常(HE×100);d:脾移植后48 d，脾组织的中心区以片状坏死为主，红、白髓结构不清(HE×100)

图1实验组诱发肝癌移植脾情况

3讨论

DEN是一种很强的化学毒剂，作用的靶器官主要是肝，其诱发的大鼠肿瘤多为肝细胞癌，与人肝细胞癌发生过程相似，常被用于肝癌动物模型的制备[7-10]。脾脏是机体最大的免疫器官，具有很强的抗癌能力，如人类脾本身的恶性肿瘤发生率比其他实质性脏器要少，有实验也表明以DEN诱发大鼠肝癌, 脾切除组大鼠的成癌更快、数目更多、直径更大[11]。

恶性肿瘤的病因及发病机制尚不完全清楚，可以认为，恶性肿瘤的发生不仅是肿瘤自身的病变，也是一种全身性、系统性病变，这包括机体免疫功能的病变，即对恶性肿瘤免疫监视和免疫排斥能力减弱。鉴于此，我们设想，肝癌发生时作为机体最大的免疫器官脾也发生了病变，其免疫功能减退，不能对肝癌的发展起到抑制作用。因此，我们设计了该实验，即将健康大鼠的“正性脾”切除后冻存，此时脾属健康脾,具有正常的免疫功能，待诱导肝癌成功后再将冻存的脾予以自体移植，以此来检验正性脾的抗癌作用。

本实验表明，正性脾自体移植组肝癌大鼠的生存期明显高于假手术组，血清AFP低于假手术组，表明移植的脾组织发挥了抗癌作用，但是，脾移植组大鼠术后最长生存期为48 d，最终死于癌肿的增大和破裂出血，表明移植脾在生存期内发挥的抗癌作用是有限的。有资料表明，小鼠大网膜内自体脾移植2个月后出现白髓、红髓结构，术后6个月其结构和功能才接近正常[12-13]。因此本实验可能是出现了这种情况，肝癌的发展速度快于移植脾的生长速度，即移植脾尚未恢复到完全发挥其功能的时候，大鼠已过早地死亡。我们观察到移植脾48 d时脾组织仍以坏死为主。如果我们能采取一些措施延缓肝癌的发展(如肿瘤切除)或加速移植脾功能的恢复，如肝表面脾片移植[14]，此不失为一种治疗肝癌的非常有效的方法。

临床上器官或组织移植治疗恶性肿瘤的方法很多，如肝移植治疗肝癌，骨髓移植治疗白血病等，这些移植无论配型如何成功，或多或少都会表现出排异反应，且免疫抑制剂的应用常促进肿瘤的复发[15]。本实验设计的出发点不同于上述的器官或组织移植，我们是基于一种“自救”的想法设计了该实验：假设全身的免疫功能降低是恶性肿瘤发生的原因，则在恶性肿瘤发生前预存一些自体免疫器官或组织，待肿瘤发生后再移植这些器官或组织使其发挥抗肿瘤作用。基于这种“自救理论”，我们还将进行一系列的实验研究。

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(编辑：左艳芳)

Therapeutic effect of splenic autologous transplantation on rat liver cancer induced by DEN

HAN Dian-bing,LIANG Ling,ZHANG Zhao-yang,ZHAO Gang,FENG Da-meng(1.Department of Hepatobiliary Surgery,Fourth People’s Hospital of Ruzhou City,Ruzhou Henan 467500;2.Department of Pharmacy,Maternity and Child Care Centers of Linyi City,Linyi Shandong 276000;3.Department of General Surgery,First Hospital of Ruzhou City,Ruzhou Henan 467500,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of autologous transplantation of spleen on rat liver cancer induced by DEN. MethodsForty rats were randomly divided into A and B group on average.Total spleens of 40 rats were resected, which preserved in liquid nitrogen.All splenectomy rats were feeded with DEN to induce hepatocellular carcinoma.After 12 weeks ,all rats which had were successfully induced liver cancer were transplanted by autologous spleen in group A.Group B were sham operation as control. ResultsSurvival period was significantly higher in group A than that in group B.But transplanted splenic tissue had not recovered to normal morphological structure until these rats died. ConclusionAutologous transplantation of spleen has therapeutic effect for liver cancer induced by DEN.

Keywords:spleen;transplantion;liver cancer;treatment

[收稿日期]2014-09-29[修回日期] 2014-10-27

doi:10.11659/jjssx.09E014014

[中图分类号]R657.6；R735.7

[文献标识码]A

[文章编号]1672-5042(2015)02-0138-03