外源氮对盐胁迫条件下长春花生长和氮代谢途径的影响1)

朱虹 郭晓瑞

(东北林业大学，哈尔滨，150040) (森林植物生态学教育部重点实验室(东北林业大学))

责任编辑:任 俐。

盐胁迫是农业生产的主要限制性因素，盐胁迫通过改变水势和离子分配来扰乱植物体激素水平，从而阻止植物的生长，并且产生氧化胁迫。盐胁迫对植物的伤害程度取决于胁迫程度、生长环境和植物对盐的敏感程度。对于盐土植物，盐胁迫会使无机离子聚集，主要是钠离子和氯离子储存在液泡中。氮肥不仅可以促进植物的生长还可以降低盐胁迫对植物的伤害［1］，而氮素的形态可以改变植物的生长、产量和植物组织中的化学成分［2-4］。宏观上，增施氮肥，主要是增大了叶面积，有利于后期干物质的积累和作物氮素同化，促进了蛋白质和其他含氮化合物的合成，增强了作物的持水力，缓解了土壤水分胁迫对作物造成的不良影响［5-6］。氮素是叶绿素的主要成分，施氮一般能促进植物叶片叶绿素的合成。有文献报道，用NH+4和NO-3混合氮源与只有硝酸作为氮源的大麦相比［7］，前者可以大大增加作物的生物量产量，从而减少了盐胁迫的作用。

长春花繁殖能力强，全年开花结果，种子数量较多，生活周期较短，生境类型较多，同时不同氮素生境下的长春花植株在生活史过程中表现出较强的可塑性，因而，其是研究植物生理生态学较好的材料之一，对长春花不同氮素形态和盐胁迫条件下的研究为具有相似生活史过程的其他物种的研究提供了参考资料，同时作为一种热带和亚热带植物，从地理带划分上也丰富了生理生态学理论。同时，有关长春花体内对人类有利用价值的药用成分，诸如长春碱等生物碱在长春花完成其整个生活史的过程中的生态学意义的深入研究对于栽培、保护利用长春花有很重要的意义。把氮素和盐胁迫条件下生长指标的理论应用到长春花的生产实践中去，对于更好地开发利用和保护长春花更有不可估量的经济价值和现实意义，为长春花下一步的全国大面积的推广栽培及工业化、生态化经营和以后长春碱、长春新碱等生物碱的工业化生产提供基础数据和重要依据。

1 材料与方法

试验于2008年6—8月份在森林植物生态学教育部重点实验室(东北林业大学)温室内进行。材料为正常沙壤土中生长一致的长春花幼苗，待其长出第三对叶片后，洗净根部沙土，移栽到珍珠岩中培养。设置氮源形态分别为:100% NO-3(无盐)、100%NO-3+200 mmol·L-1NaCl、50% NO-3+50% NH+4(无盐)、50% NO-3+50% NH+4+200 mmol·L-1NaCl、25%NO-3+75% NH+4(无盐)、25% NO-3+75% NH+4+200 mmol·L-1NaCl、100%谷氨酰胺(无盐)、100%谷氨酰胺+200 mmol·L-1NaCl。

硝酸还原酶(NR)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)等氮代谢酶活性的测定:硝酸还原酶的活性测定参照α-萘胺法［8］。分别将长春花的根和叶片在液氮条件下研碎，精确称取0.2 g，加入磷酸缓冲提取液1 mL(25 mmol·L-1磷酸缓冲液加1 mmol·L-1EDTA 和10 mmol·L-1半胱氨酸，pH 值8.8)，4 ℃下离心(18 000 r·min-1，15 min)后提取上清液为待测酶液。吸取0.5 mL KNO3溶液、0.3 mL NADH 和0.2 mL 酶液，混合后在25 ℃下保温30 min。保温结束后，立即加入0.5 mL 1%氨基苯磺酰胺和0.5 mL 萘基乙烯二胺水溶液，静置15 min 以上，用酶标仪在492 nm 处测定光吸收，以不加NADH 的(加入0.3 mL 水)作为空白对照。样品的光吸收减去空白对照的光吸收等于光吸收的增量，即为1 mL 反应液中在保温30 min 内，由于酶的作用而增加的NO-2 数量，从标准曲线中计算该光吸收的增量相当于多少微克的NO-2。

谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脱氢酶活性(GDH)测定参照Lu et al.［9］的方法。测定GS 活性用100 mmol·L-1、pH 值7.6 的Tris-HCI 缓冲液提取酶。酶活性反应液组成为0.6 mL 咪唑盐酸缓冲液、0.4 mL 谷氨酸钠溶液、0.4 mL ATP2Na 溶液(30 mmol·L-1，pH 值7.0)、MgSO4溶液(0.5 mol·L-1)、酶提取液1.2 mL。反应液0.2 mL 在25 ℃水浴中保温5 min，加入0.2 mL 羟胺试剂开始反应，在25 ℃水浴中反应15 min，加入0.8 mL 反应终止液终止反应，酶活性反应液在4 000 r·min-1条件下离心15 min，用紫外分光光度计在540 nm 处测定上清液的光密度。一个GS 活性单位定义为该反应条件下，在15 min 反应时间内催化形成1 μmol γ-谷氨酰异羟肟酸需要的酶量，总活性为每克鲜样酶粗液在15 min 的反应时间内催化形成γ-谷氨酰异羟肟酸的微摩尔数。在NADH-GDH 活性反应系统中，每分钟光吸收0.001 的变化，为酶的活性单位。

游离氨基酸的检测方法:采用AccQ·Tag 方法测定。仪器和试剂为Waters Alliance 色谱系统，1525-717 系统，2487 紫外检测器，Millennium 色谱管理系统;反相C18柱(3.9 mm×150 mm)。AccQ·Tag流动相A 浓液，AccQ·Flour 衍生剂和2.5 mmol·L-117AA 标准溶液(Waters 公司)，超纯水。色谱条件，流动相:A 液(Waters 公司)，V(A 液)∶V(超纯水)=1 ∶10，B 液为V(乙腈)∶V(水)= 60 ∶40;流速为1.0 mL·min-1，柱温为37 ℃，检测波长为248 nm，进样量为10 μL。

形态学参数的设定及取样方法:采用表型相关法，即通过选择与植物生长和发育相关的一些参数，如株高、基茎、节间长、生物量等，运用统计学方法对这些数据之间及与生境参数之间进行相关性分析，从而反映植物生长及受生境的影响情况。

2 结果与分析

2.1 外源不同形态氮素条件下长春花抗盐胁迫的形态学指标

在有盐和无盐条件下，外施不同氮源对长春花的生长影响显著(表1)。当谷氨酸和50% NO-3+50%NH+4作为氮源时，发现无盐和加盐处理的长春花幼苗株高发生显著变化。在盐胁迫条件下，外施谷氨酸，长春花株高降低，说明盐胁迫使长春花株高降低。但是，在盐胁迫条件下，外施各种氮源，都促进基茎增大;硝酸盐、谷氨酰胺分别单独作为氮源时，基茎增加较显著。

观察盐胁迫条件下，外施不同氮源对长春花幼苗叶片鲜质量和干质量的影响表明，盐胁迫条件下，外施不同氮源，显著促进了长春花幼苗叶片鲜质量和干质量的增加，说明外施不同氮源可以提高长春花抵抗适量盐胁迫的能力。

表1 不同氮素形态条件下长春花抵抗盐胁迫表型性状的变化

2.2 外源不同形态氮素条件下长春花抵抗盐胁迫体内初级氮代谢酶的变化

在不同形态氮素条件下，硝酸还原酶(NR)变化显著(表2)。在硝酸单独作为氮源和50%NO-3+50%NH+4作为氮源时，加盐处理的NR 水平要显著高于无盐处理的。但加盐处理时，同时加其他两种氮源(25%NO-3+75%NH+4和谷氨酰胺)处理时，NR水平要显著低于无盐处理。可以看出，当硝酸盐质量分数＞50%，加盐处理时的NR 活性显著提高。

当硝酸盐和谷氨酸为氮源时，GS(谷氨酰胺合成酶)活性的加盐处理水平要显著高于无盐处理的，当50% NO-3+50% NH+4和25% NO-3+75% NH+4为氮源时，在无盐处理时，GS 活性要显著高于加盐处理的。

GDH(谷氨酸脱氢酶)活性除在以25% NO-3+75% NH+4为氮源之外，其他3 种氮源处理时，加盐处理的GDH 活性均显著高于无盐处理的，并且4 种氮源条件下加盐处理的GDH 活性相似，随着氨离子质量分数的增加，无盐处理的GDH 活性水平也显著增加。

表2 长春花幼苗在不同形态氮素条件下抵抗盐胁迫叶片中NR、GS 和GDH 活性变化

2.3 外源不同形态氮素条件下长春花抵抗盐胁迫体内游离氨基酸总质量分数的变化

氨基酸是植物体内重要的代谢物质，是构成蛋白质的成分，而蛋白质又是基因的产物和表达形式，所以，氨基酸质量分数的变化在很大程度上反应了植物体内氨基酸代谢的变化，反应了遗传上的变异性［9-11］。有许多研究表明，氨基酸质量分数与盐胁迫存在一定的相关关系。由表2可知，游离氨基酸总质量分数在硝酸盐单独作为氮源时，氨基酸总质量分数无盐处理的显著高于加盐处理的;25% NO-3+75% NH+4作为氮源时，氨基酸总质量分数加盐处理的显著低于无盐处理;50% NO-3+50% NH+4和谷氨酰胺分别为氮源时，无盐处理的氨基酸总质量分数显著高于其他氮源的，但盐胁迫抵制了氨基酸总质量分数。

3 结论与讨论

盐胁迫是植物生长的主要限制性因素，植物受伤害的大小要依赖于盐胁迫程度、生长条件和植物对盐的敏感性。不同氮源条件下长春花的生长在无盐和加盐处理时受到很大影响。有文献报道［12］，用NH+4和NO-3混合氮源与只有硝态氮作为氮源的大麦相比，前者可以大大增加作物的生物量，并且证明这种增高与单位面积上的光合作用没有联系，而主要是通过增加了光合作用在整个叶面积上的利用率。这种低质量分数的NH+4对生长的刺激作用与能量的节省有关，代谢NO-3对能量的需求是20 分子的ATP/NO-3，而NH+4只需要5 分子的ATP，当氮在根中代谢时，氨将节省8%～12%的能量，在茎中节省3%～6%［1］;另一个原因可能是，当只用NH+4作为氮源时，ABA 合成的醛氧化酶活性以及ABA含量均有显著增加。但当外源氨态氮浓度过大，超过根系的代谢吸收能力时，就会使根溶液酸化［3］。另外，外源氨态氮能促进谷氨酰胺、脯氨酸以及其他渗透调节物质的合成和积累，从而提高植物的耐盐性［7］。胡润芳等［14］报道，氨态氮增加3 个大豆品种功能叶片NR(硝酸还原酶)活性效果最好，3 个大豆品种的植物中GS(谷氨酰胺合成酶)活性增加［13］。本试验证明了与硝酸作为氮源相比，无论是盐胁迫还是正常生长的大麦氨态氮源都可以使GS 活性增加。另一方面，GOGAT(谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶)活性没有明显的改变。由此推测，这可能会导致谷氨酰胺源的增加，也会导致对氮同化的消极反馈。在响应外源不同氮素的过程中，对GDH(谷氨酸脱氢酶)的功能目前还不是很清楚。尽管基因表达和酶的活性试验结果都表明，GDH 在植物体内的主要功能是参与谷氨酸的分解代谢，但Magalhães et al.［15］发现，缺失GDH 的玉米突变体植株不能吸收利用外源氨态氮，而与之对照的野生型植株就可以吸收利用氨态氮。Lasa et al.［16］的研究也认为，GDH 对于大豆吸收利用氨态氮具有重要作用。这些试验结果都说明在植物体内，GDH 可以催化氨的合成反应。尤其是在高氨质量分数下，植物中的GDH 的活性因为受到诱导而增加，以同化氨而尽可能降低氨的毒害［17］。另外，据Ota et al.［17］报道，在全氨营养时，萝卜植株叶片中游离氨基酸以谷氨酰胺、丝氨酸、精氨酸和脯氨酸为主;而全硝营养时主要组分为天冬氨酸和谷氨酸，且游离氨基酸的总量低于全氨营养。Lasa et al.［16］的研究也表明，全氨营养时菠菜茎叶中游离氨基酸以谷氨酰胺和精氨酸为主;在全硝营养时，以谷氨酸和天冬氨酸为主。

在生理学方面，适量的氨态氮和谷氨酸氮源可以促进长春花游离氨基酸总质量分数的积累。当硝酸盐质量分数＞50%时，加盐处理的NR 活性就越高。GS 活性在单独硝酸盐和谷氨酰胺为氮源时加盐处理水平分别显著高于无盐处理的。随着氨离子质量分数的增加，无盐处理的GDH 水平也显著增加。游离氨基酸总质量分数在硝酸盐单独作为氮源时，加盐处理诱导其总质量分数大部分显著低于无盐处理的［18-20］。总之，混合氮源可以减少盐胁迫对长春花的伤害。这种作用可能和氮代谢过程中关键酶活性的增加有关，特别是和氨代谢有关的酶，适量的氨离子可以节省植物代谢硝态氮的能量［19］，但是过量的氮会使植物受到毒害作用;另外，有机氮如谷氨酰胺对长春花抵抗盐胁迫也有一定的作用。

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