大庆油田低渗透油藏假单胞菌的筛选及性能评价1)

张虹 任国领 徐晶雪 郎亚军 丁海燕 黄永红

(大庆师范学院，大庆，163712)

责任编辑:程 红。

微生物采油技术(MEOR)作为大庆油田一项重要的接替技术，在大庆油田聚驱后油藏、低渗透油藏等油藏区块进行了多个现场矿场试验应用，试验效果较理想［1－3］。微生物采油技术包括内源微生物采油、外源微生物采油和直接注入微生物代谢产物以提高采油率等技术［4］，而外源微生物采油技术的关键是从油藏或者其它环境中分离和筛选性能优良的微生物采油菌株。微生物采油技术提高原油采收率的机理主要包括:微生物对原油的乳化降解;微生物产生的表面活性剂、有机酸及生物气等代谢产物影响原油的物理化学性质，如降低原油黏度、减小油/岩及油/水接触面的表面张力、改善原油的流动性等［5－6］。笔者从大庆油田低渗透油藏采出液中筛选得到以原油为唯一碳源的微生物菌株，命名为QSJU002，对筛选的菌株QSJU002 进行生理生化特征和16S rDNA 分子生物学鉴定，并根据测序得到的16S rDNA 基因序列进行了荧光原位杂交(FISH)探针的设计。同时，从其降解原油、产表面活性剂、产酸、乳化原油和耐盐等采油性能方面探讨了将其应用于MEOR 的可行性。

1 材料与方法

试验样品取自大庆油田低渗透油藏采油十厂采出液。

菌株的富集和筛选:取适量大庆油田低渗透油藏采出液于富集培养基(LB 培养基)中，放入37 ℃、转速为150 r·min－1恒温摇床中培养48 h，菌种富集培养。从中取5 mL 的上清液加到100 mL 以原油为唯一碳源的选择培养基中，培养48 h 后，将菌液制备梯度稀释液(10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6倍)，逐一标记，分别取100 μL 稀释液加到选择培养基固体平板上，37 ℃恒温培养2～3 d 至菌落出现。

菌株的纯化:菌株的纯化参考文献［7］。挑取不同形态的单菌落三区划线，进行菌落形态和显微镜观察，重复划线分离，直到确定其为单一菌株为止，纯化菌株保存于LB 斜面培养基上，于冰箱中4℃保存。

菌株的生理生化特征鉴定:进行淀粉水解、糖发酵、产气、革兰氏染色、V－P 试验、吲哚试验、柠檬酸盐试验、明胶水解试验，具体方法参见文献［8］。

菌株的分子生物学鉴定参见文献［9］－［11］。

菌株的采油性能评价:利用菌株对液体培养基石油的降解试验、排油圈试验、产酸试验、乳化性能试验和矿化度耐受性试验进行菌株降解原油、产表面活性剂、产酸、乳化原油和耐盐等采油性能的评价。①降解试验。将纯菌株活化，以5%接种量接种于石油液体培养基中，培养48 h 观察培养液中石油状态。②排油圈试验。在培养皿中加入约10 mL蒸馏水，在蒸馏水中心加入2 mL 液体石蜡，为便于观察，滴入染色液美蓝，等液体石蜡扩散成油膜时，在油膜中心加人2 mL 离心的发酵液，测定排油圈的的直径。据张凡等［12］报道，排油圈的直径和表面活性剂的量成正比。③产酸试验。采用酚酞滴定法进行菌株产酸能力测定，取菌株发酵液50 mL，以酚酞为指示剂，用0.1 mol·L－1NaOH 进行滴定，并留未接菌的发酵液作为对照。

菌株乳化性能测定:取菌株48 h 培养液，5 mL于8 000 r·min－1离心20 min，取上清液，加入等量二甲苯，漩涡震荡5 min 后，分别放置24、48、72 h 观察乳化效果。

菌株矿化度耐受性测定:将斜面保藏菌株接种于石油培养基中活化48 h，以5%接种量接种于10% NaCl 浓度梯度培养液中，分别培养24、48 h，用分光光度计测定菌株生长状况。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选与纯化

从大庆油田低渗透油藏采出液中经过富集、筛选和纯化等步骤得到1 株以原油为唯一碳源的微生物菌株，命名为QSJU002。

2.2 菌株的生理生化特征

对分离的菌株QSJU002 进行革兰氏染色及生理生化特征试验。结果显示，该菌株属于革兰氏阴性菌，糖酵解、淀粉水解、甲基红试验、柠檬酸盐试验、明胶水解试验、牛奶石蕊试验为阳性，产气试验、吲哚试验为阴性。根据常用细菌鉴定方法，初步鉴定菌株QSJU002 为假单胞菌属。

2.3 菌株的16S rDNA 序列分析

菌株16S rDNA 全序列(省略)拼接结果显示:菌株QSJU002 16S rDNA 全长序列含有bp 核苷酸。将测得的序列与GenBank 中已报道的细菌菌株的16S rDNA 序列进行同源性比较。结果(表1)显示，菌株QSJU002 16S rDNA 序列与最相近的前十个菌株的GenBank 相似性均为100%。

2.4 菌株系统发育进化树的创建

将QSJU002 16S rDNA 全长序列与BLAST 比对得到的前十个最相近菌株的16S rDNA 序列利用MEGA4 软件进行构建系统发育树(图1)。由图1可见，QSJU002 与Pseudomonas aeruginosa strain JBP－16(KM675945.1)碱基差别最小。由生理生化特征检测、16S rDNA 鉴定结果可知，菌株QSJU002 与Pseudomonas aeruginosa strain JBP－16 亲缘关系最近，属于假单胞菌属。

表1 GeneBank 中与菌株QSJU002 亲缘关系最近的前十个菌株

图1 基于QSJU002 和亲缘关系最近的前十个菌株的16S rDNA 构建的NJ 系统发育树

2.5 菌株荧光原位杂交探针的设计

荧光原位杂交技术已在已知油藏微生物菌株的快速监测中得到应用［13］。荧光原位杂交探针的制备是荧光原位杂交的关键一步［14］，菌株的16S rDNA 序列的鉴定为探针的制备的基础。根据寡核苷酸探针设计的基本原则［15］和QSJU002 菌株的16S rDNA 序列特征，设计了QSJU002 菌株的2 个荧光原位杂交探针:探针1，5'－GGTCTGAGAGGATGATCAGT－3';探针2，5'－GTCTGAGAGGATGATCAGT－3'。

2.6 菌株性能的评价

由表2所示，QSJU002 菌株在石油培养基中生长时，能够使石油培养基出现颗粒均匀的小油滴，初步表明QSJU002 菌株具有降解原油的特征;QSJU002 菌株产生的排油圈直径为5.6 cm，表明QSJU002 菌株具有产表面活性剂的功能;QSJU002菌株与空白对照组相比消耗NaOH 的量有所增加，表明QSJU002 菌株有一定的产酸能力;在10% NaCl浓度下QSJU002 菌株的生长状况良好，表明QSJU002 菌株具有较好的矿化度耐受性。

表2 菌株QSJU002 采油性能评价

3 结论

通过富集培养、梯度稀释涂布、平板三区划线等技术，在大庆油田低渗透油藏采出液中分离纯化得到1 株微生物菌株，命名为QSJU002，该菌株能够在以原油为唯一碳源的选择性培养基上生长。

结合生理生化特征检测、16S rDNA 分子生物学鉴定，菌株QSJU002 与Pseudomonas aeruginosa strain JBP－16 亲缘关系最近，属于假单胞菌属。

根据寡核苷酸探针设计的基本原则和QSJU002菌株的16S rDNA 序列特征，设计了2 个QSJU002菌株的荧光原位杂交探针，分别是:探针1，5'－GGTCTGAGAGGATGATCAGT－3';探针2，5'－GTCTGAGAGGATGATCAGT－3'。

性能评价结果表明，菌株QSJU002 具有降解原油、产生物表面活性剂、产酸、乳化原油、耐盐性等采油性能，具有较好的MEOR 应用前景。

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