HPLC-DAD快速测定饮品中咖啡因含量

盛美意　周心艳　方　萍　李秀东

(1.绍兴文理学院　化学化工学院　浙江　绍兴312000；2.绍兴文理学院　元培学院　浙江　绍兴312000)



HPLC-DAD快速测定饮品中咖啡因含量

盛美意1周心艳2方萍1李秀东1

(1.绍兴文理学院化学化工学院浙江绍兴312000；2.绍兴文理学院元培学院浙江绍兴312000)

摘要：建立了一种快速测定饮品中咖啡因的高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD法).流动相为甲醇-乙腈-0.1%甲酸水溶液(20∶10∶70)，检测波长273 nm，流速1.0 mL/min.结果表明，在咖啡因浓度为0.003~0.120 mg/mL范围内，线性良好(R2=0.9999)；方法精密度RSD为1.75%；重复性RSD为0.51%；平均加标回收率为99%~103%.

关键词：高效液相色谱-二极管阵列检测法；咖啡因；饮品

0引言

咖啡因是日常饮料中的主要成分，如1g雀巢咖啡约含咖啡因35 mg，1g茶约含咖啡因20～35 mg，1 000 mL可乐饮料含咖啡因90～100 mg[1].在北美，一个成年人平均每天摄入咖啡因约200～250 mg，我国咖啡因的消耗量也在逐年增加[2].咖啡因是中枢神经系统的兴奋药，不仅对心血管系统具有正性作用，还能促进胃酸分泌和治疗偏头痛等疾病.适度地使用咖啡因有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏.但大剂量或长期使用也会对人体造成损害，特别是它具有成瘾性，一旦停用会出现精神萎靡不振、浑身困乏等各种戒断症状，因此被列入受国家管制的精神药品范围[3].

可乐型饮料、咖啡、茶叶及制成品中咖啡因含量的测定方法有许多，有薄层色谱法[4]、紫外光谱分析法[5-6]、色-质谱联用(GC-MS法)、高效毛细管电泳(HPCE)等.其中高效液相色谱法[7-13](HPLC)是最为普遍和实用的.本实验主要以绿茶为代表性样品，用正交试验对其中咖啡因的提取条件进行了优化，同时对HPLC条件进行了优化，并用优化好的方法对不同种类饮品中的咖啡因进行了测定.

1实验部分

1.1　仪器和材料

实验仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司，配二极管阵列检测器)；SK3210HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；UPWS超纯水器(杭州永洁达净化科技有限公司)；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司).

实验材料：咖啡因(GBW(E)130142)为高纯度(天津市计量监督检测科学研究院)；甲醇、乙腈为色谱纯(美国天地试剂有限公司)；无水甲酸、三氯甲烷均为分析纯(上海凌峰化学试剂有限公司)；实验用水均为超纯水，取自ΜPWS超纯水器；7种不同种类饮品均购自超市.

1.2　咖啡因标准品配制

别为0.003、0.006、0.012、0.030、0.060、0.120、10.000 mg/mL的咖啡因对照品溶液.

1.3　样品制备

液体样品：取脱气后试样10 mL，过0.45 μm微孔滤膜，取1mL续滤液备用.

茶及咖啡类等固体样品：精密称取粉碎均匀的样品100.0 mg，加水适量，定容至100.0 mL，摇匀，超声提取60 min，进行脱气至无气泡产生.取10 mL过0.45 μm微孔滤膜，取1 mL续滤液备用.

1.4　HPLC的条件

色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6×150 mm，5 μm)，流动相为甲醇-乙腈-0.1%甲酸=20∶10∶70，进样量20 μL，流速1.0 mL/min，检测波长273 nm.

2结果与讨论

2.1　色谱条件的优化

2.1.1流动相的选择

在保持其他色谱条件相同的情况下，分别在流动相为甲醇-乙腈-0.1%甲酸=20∶10∶70[9]，甲醇-乙腈-水=57∶29∶14(每升流动相中加入0.8 mol/L乙酸液50 mL)[11]，甲醇-水=23∶77[13]下观察咖啡因的出峰效果和峰形，实验结果如图1所示.图1表明，流动相为甲醇-乙腈-0.1%甲酸=20∶10∶70时峰形最好，分离效果最佳.

图1　咖啡因在不同流动相中的高效液相色谱图

2.1.2检测波长的选择

用二极管阵列检测器在线扫描咖啡因标准溶液，实验结果如图2所示.图2表明，咖啡因标准溶液最大吸收波长分别是210 nm和273 nm，因在210 nm处测样品时有杂质干扰，故选定273 nm为检测波长.

图2　咖啡因紫外吸收图

2.2　咖啡因前处理方法的选择

对绿茶中咖啡因的提取方法、提取溶剂、提取时间等因素进行(2×3×3)正交试验，实验结果见表1.由表1可见，提取方法为超声、提取溶剂为超纯水、提取时间为60 min的方法最佳，峰面积最大，故选取这一方法为样品中咖啡因的提取方法.

今宁波设立的“平字水则”建立在宋宝祐年间（1253—1258年）的古“平字水则”基础上。据史书记载，在温州谯楼前五福桥上的“永嘉水则”为宋元祐三年（1088年）所立，比宁波“平字水则”早170年，并具有管理运用功能，是至今为止发现最早的 “平字水则”。出土于温州的“开平闸”石刻，显然与“平字水则”有着必然的联系，“平字水则”的“平”字极有可能取自“开平闸”的简化运用。因此，“开平闸”石刻很可能是“平字水则”的前身，“平字水则”是其演化的结果。它既是石刻记录，又具运用调度功能，是“水则”发展史中第二阶段到第三阶段的过渡。

表12×3×3正交试验

序号方法溶剂时间/min峰面积1超声超纯水201340.42超声超纯水401529.93超声超纯水601571.74超声甲醇201273.35超声甲醇401495.76超声甲醇601501.77超声三氯甲烷2096.28超声三氯甲烷40115.59超声三氯甲烷60122.410浸泡超纯水201220.311浸泡超纯水401368.412浸泡超纯水601456.913浸泡甲醇201166.814浸泡甲醇401349.615浸泡甲醇601397.216浸泡三氯甲烷2087.817浸泡三氯甲烷40102.918浸泡三氯甲烷60116.7

2.3　线性范围、精密度、重现性及回收率

将配置好的咖啡因标准溶液按以上色谱条件测定，以峰面积对浓度作标准曲线，可得在0.003～0.120 mg/mL浓度范围内的线性回归方程为：

Y=56136x+29.303，

其相关系数R2=0.9999.此方法既好又宽的线性范围可以满足不同种类饮品咖啡因含量的测定.

精密吸取0.03 mg/mL的咖啡因标准溶液20 μL，重复6次进样，计算峰面积的相对标准偏差(RSD)为1.75%，小于2%，说明仪器精密度良好.

取同一批绿茶样品6份，每份精密称取100.0 mg，按以上方法制备样品并测定，得到绿茶中咖啡因平均含量是27.51 mg/g，RSD为0.51%，说明该方法的重现性好.

在绿茶样品中分别加入咖啡因标准品1.00 mg、2.00 mg、5.00 mg，按以上方法制备样品并上机测试，根据在实际样品中提取出的咖啡因含量和标准品含量之比计算回收率，得平均回收率为99.16%～103.38%，具体实验结果见表2.表2结果说明，该提取方法切实可行，具有很好的准确度.

2.4　实际样品的测定

分别取康师傅绿茶、康师傅冰红茶、百事可乐、绿茶、大肚子茶、摩卡特浓奶茶、摩卡咖啡等饮品，按以上方法制备样品并上机测试，结果见表3.

表2绿茶中咖啡因的加标回收率实验结果(n=3)

样 品本底值/(mg·g-1)加标量/mg平均测定值/(mg·g-1)回收率/%绿茶1绿茶2绿茶327.711.0037.6299.162.0047.86100.755.0079.40103.38

表3不同饮品的咖啡因含量的测定结果

名 称含 量(mg/mL或mg/g)康师傅绿茶10.13康师傅绿茶20.14康师傅冰红茶10.07康师傅冰红茶20.07百事可乐10.11百事可乐20.11绿茶128.16绿茶227.94大肚子茶110.63大肚子茶210.56摩卡特浓奶茶11.51摩卡特浓奶茶21.48摩卡咖啡134.15摩卡咖啡234.20

3结论

本文利用高效液相色谱-二极管阵列检测法快速测定了饮品中咖啡因的含量，探讨了咖啡因的提取方法并优化了色谱条件.该方法的提取溶剂为超纯水，对环境友好，分析速度快，仪器测试时间在10 min内完成，极大地节约了测试成本，提高了工作效率.同时对不同饮品中的咖啡因进行了测定分析.该方法线性范围宽，具有良好的重现性和回收率，可用于不同种类饮品中咖啡因含量的测定.

参考文献:

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[3]武开业．反相高效液相色谱法测定茶叶中咖啡因的含量[J]．化学工程与装备，2010，8(5)：142-143．

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[5]孙延春，张英．紫外分光法测定饮料中的咖啡因含量[J]．化学研究，2011，22(1)：77-79．

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(责任编辑邓颖)

Rapid Determination of Caffeine in Beverages by HPLC-DAD

Sheng Meiyi1Zhou Xinyan2Fang Ping1Li Xiudong1

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shaoxing University, Shaoxing, Zhejiang 312000;

2. College of Yuanpei, Shaoxing University, Shaoxing, Zhejiang 312000)

Abstract：An analytical method for rapid determination of caffeine in beverages was established by high performance liquid chromatography-diode array detection. The chromatography conditions were optimized as follows: Mobile phase consisted of methanol-acetonitrile- 0.1% formic acid (20∶10∶70), the detection wavelength was set at 273 nm, and the flow rate was 1.0 mL/min. The results showed that there was a good linearity within the range of 0.003~0.12 mg/mL(R2=0.9999). The Precision RSD was 1.75%. The repeatability RSD was 0.51%. The average recovery was 99%~103%. This simple, rapid, accurate and reproducible method can be used as an analysis method for determining caffeine in beverages.

Key words：HPLC-DAD; caffeine; beverage

中图分类号：O657.7

文献标志码：A

文章编号：1008-293X(2015)10-0021-03

doi：10.16169/j.issn.1008-293x.k.2015.10.05

*收稿日期：2015-06-08基金项目：绍兴文理学院校级科研项目(2014LG1003)

作者简介：盛美意(1987-)，女，浙江新昌人，实验师，硕士，研究方向：色质谱分析.