多西他赛联合顺铂对肺癌A549细胞热休克蛋白70表达的影响

刘　莉, 袁　红, 马　玲, 单　莉

(1. 新疆医科大学附属肿瘤医院 肺内科; 2. 中国人民解放军第四七四医院 呼吸科, 新疆 乌鲁木齐, 830011)



多西他赛联合顺铂对肺癌A549细胞热休克蛋白70表达的影响

刘莉1, 袁红2, 马玲1, 单莉1

(1. 新疆医科大学附属肿瘤医院 肺内科; 2. 中国人民解放军第四七四医院 呼吸科, 新疆 乌鲁木齐, 830011)

摘要:目的探讨多西他赛联合顺铂对人肺癌细胞株(A549细胞)热休克蛋白70(HSP70)表达的影响。方法体外培养肺癌A549细胞，分别采用多西他赛20μg/mL、顺铂5μg/mL及二者联合用药处理细胞，另设不加药物处理的对照组，MTT法检测A549细胞增殖活力；同时采用Western Blot检测顺铂、多西他赛及二者联合用药分别处理细胞后，HSP70表达量的变化。结果MTT法显示，多西他赛、顺铂、多西他赛联合顺铂处理A459细胞后，细胞增殖明显受到抑制，细胞活性明显低于对照组(P<0.01); 联合组细胞活性显著低于多西他赛组和顺铂组(P<0.01); Western Blot显示，多西他赛组、顺铂组、联合组HSP70表达均降低(P<0.05或P<0.01); 联合用药组HSP70表达低于单独用药组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论多西他赛与顺铂均具有抑制肺癌A549细胞的增殖作用，二者联用具有协同作用，其机制可能与下调HSP70的表达有关。

关键词:多西他赛; 顺铂; 热休克蛋白70; A549细胞

热休克蛋白(HSP)是机体在不良环境因素应激作用下产生的具有高度保守性的一种应激蛋白，它通过影响细胞增殖过程的蛋白构象进而参与调节细胞周期，并与肿瘤细胞的增殖密切相关[1]。HSP70是HSP中重要的一种蛋白，在细胞应激后生成较为显著，且对细胞损伤具有保护作用[2]。研究表明，HSP70与癌基因、抑癌基因及其产物相互作用，调节细胞的增殖，在一些肿瘤，如肺癌、胰腺癌组织中有不同程度的表达[3-4]。肺癌为目前世界各国发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤，对人类健康造成极大的威胁。化疗是肺癌治疗的主要途径，尤其是联合化疗常可获得较理想的效果。多西他赛是第三代细胞毒性化疗药，在非小细胞肺癌的治疗中表现出了良好疗效，是目前唯一得到欧洲和美国FDA批准并用于非小细胞肺癌一线化疗药物，与铂类联合治疗肺癌的效果可靠[5]。本研究通过观察临床常用化疗药多西他赛联合顺铂对体外培养的人肺癌细胞(A549细胞)增殖的影响，探讨其对肿瘤细胞的抑制机制，现报告如下。

1材料与方法

1.1　试剂与药品

多西他赛、顺铂购自江苏恒瑞医药股份有限公司；小鼠抗人HSP70单克隆抗体购自美国SantaCruz生物技术公司；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；小牛血清购自杭州四季青公司；人肺癌细胞株(A549细胞)由中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库提供，用含10%小牛血清及1%双抗的1 640培养液常规培养，取对数生长期的细胞用于后续实验[6]。

1.2　实验分组

细胞培养进入对数期后，对照组：只更换新的培养液继续培养细胞，不加药物处理；多西他赛组：弃去培养液，加入含多西他赛20 μg/mL培养液继续培养；顺铂组：弃去培养液，加入含顺铂5 μg/mL的培养液继续培养；联合组：弃去培养液，加入含两药培养液继续培养。

1.3　MTT法检测A549细胞生长变化

取对数生长期的A549细胞, 0.25%胰蛋白酶消化制备为单细胞悬液，细胞计数仪调整细胞浓度为2.5×107/L, 接种于96孔培养板内，200 μL/孔，细胞培养24 h，待细胞铁壁后弃原培养液，给予上述不同处理，各组设6个复孔，并设空白对照孔(只含培养液不含细胞)，置37 ℃含5% CO2的培养箱继续培养24 h, 取出板子。每孔加5 g/L四甲基偶氮唑盐(MTT)20 μL, 继续培养4 h后弃培养液加150 μL/孔DMSO, 室温震荡15 min, 酶标仪492 nm检测各孔吸光度(A值)，计算生长增殖率。细胞生长增殖率=(实验组A值-空白组)/(对照组A值-空白组A值)×100%。重复3次。

1.4　Western Blot法检测HSP70蛋白的表达

取对照组和不同药物处理后的A459细胞加入细胞裂解液和PMSF，在冰上反复吹打30 min使细胞充分裂解, 4 ℃, 12 000 g离心10 min, 吸取上清即细胞蛋白提取液。总蛋白行酶标仪蛋白浓度测定，调整蛋白浓度后进行SDS-PAGE电泳，电泳后蛋白转移至硝酸纤维膜上，含蛋白的硝酸纤维膜经5%脱脂奶粉封闭后分别孵育鼠抗人HSP70抗体为一抗、羊抗兔IgG为二抗，进行免疫印迹分析。孵育完抗体的硝酸纤维膜用ECL显色，应用GELPro Analyzer(4.0 version)图形分析软件进行定量分析。

2结果

2.1　各组A459细胞增殖率比较

多西他赛、顺铂、多西他赛联合顺铂处理A459细胞后，细胞活性均低于对照组，差异显著有统计学意义(P<0.01); 多西他赛组与顺铂组比较差异无统计意义(P>0.05)，联合组显著低于多西他赛组和顺铂组(P<0.01)。见表1。

表1　A459细胞增殖率比较

与对照组比较，**P<0.01; 与联合组比较，##P<0.01。

2.2　各组A459细胞HSP70蛋白的表达水平

多西他赛组、顺铂组、联合组与对照组相比，HSP70表达均降低(P<0.05或P<0.01); 多西他赛与顺铂组比较差异无统计意义(P>0.05); 联合组HSP70表达低于单独用药组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3讨论

生物细胞在受到各种理化因素和其他应激因素，如缺血、缺氧、毒物、细菌或病毒感染、DNA损伤等作用后可发生热休克反应，进而抑制一些正常蛋白质的合成，同时启动一类高度保守的基因合成HSP，此现象被称为热休克应答[6]。HSP广泛存在于原核和真核生物，具有“分子伴侣”的作用，HSP主要功能是在应激状态下保护细胞生命活动。近年有研究发现，HSP通过原癌基因和抑癌基因及其蛋白产物的相互作用以调节肿瘤细胞的增殖[7]。此外，HSP70在细胞周期调节、DNA损伤的控制、基因产物的代谢及癌变方面发挥重要的作用[8]，是肿瘤和感染性疾病免疫的重要分子，在细胞应激后生成较显著，能与多种癌基因、抑癌基因相互作用，进而参与调节肿瘤细胞凋亡、分化等过程[9]。

表2　各组A459细胞HSP70蛋白的表达水平比较±s)

与对照组比较，*P<0.05, **P<0.01;

与联合组比较，#P<0.05。

多西他赛为紫杉类抗肿瘤药物，其机制是加强微管蛋白聚合和抑制微管解聚，从而抑制肿瘤细胞有丝分裂和增殖，起到杀灭肿瘤细胞的作用[10]。体外实验表明，多西他赛在肿瘤细胞内浓度较高且在细胞内潴留时间长，对过度表达P-糖蛋白的多种肿瘤细胞株具有活性，抗肿瘤谱广[11]。顺铂是金属铂类络合，其化学结构类似于双功能烷化剂，可与DNA双键上的核酸形成链内和链间交叉联结，破坏DNA功能，具有细胞毒性作用，进而抑制肿瘤细胞DNA再复制，导致细胞死亡[12]。多西他赛联合顺铂是国际公认的非小细胞肺癌化疗一线治疗方案。Jahanzeb等[13]报道多西他赛联合顺铂每三周方案治疗ⅢB期和Ⅳ期肺癌，减少多西他赛用量可降低粒细胞下降的副作用，且不降低其有效率，中位生存期达到12个月。本研究中多西他赛、顺铂、多西他赛联合顺铂处理A459细胞后，细胞活性均低于对照组，多西他赛联合顺铂作用于A459细胞后细胞活性显著低于其他单药组，表明联合应用能协同加强细胞对药物的敏感性，抑制细胞增殖作用加强，且联合应用后HSP70表达最低，表明二者的协同作用能对抗HSP70对肿瘤的保护作用，提示联合用药对A549细胞的生长抑制作用可能是通过降低HSP70表达而发生的。

参考文献

[1]Seigneuric R, Mjahed H, Gobbo J, et al. Heat shock proteins as danger signals for cancer detection[J]. Front Oncol, 2011, 1: 37.

[2]Mcconnell J R, Alexander L A, Mcalpine S R. A heat shock protein 90 inhibitor that modulates the immunophilins and regulates hormone receptors without inducing the heat shock response[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2014, 24(2): 661.

[3]Daugaard M. The heat shock protein 70 family: Highly homologous proteins with overlapping and distinct functions[J]. FEBS Lett, 2007, 581(19): 3702.

[4]Bttinger L, Oeljeklaus S, Guiard B, et al. The mitochondrial heat shock protein 70(Hsp70) and Hsp10 cooperate in the formation of Hsp60 complexes[J]. J Biol Chem, 2015, 290(18): 11611.

[5]申洁, 贺外信. 多西他赛联合顺铂治疗非小细胞肺癌近期疗效观察[J]. 中华实用诊断与治疗杂志, 2012, 26(1): 68.

[6]Miao J, Niu J, Wang K, et al. Heat shock factor 2 levels are associated with the severity of ulcerative colitis[J]. Plos One, 2014, 9(2): e88822.

[7]Coco M, Caggia S, Musumeci G, et al. Sodium L-lactate differently affects brain-derived neurothrophic factor, inducible nitric oxide synthase, and heat shock protein 70 kDa production in human astrocytes and SH-SY5Y cultures[J]. J Neurosci Res, 2013, 91(2): 313.

[8]Jahanzeb M, Sarna G, Hirsch R, et al. Docetaxel and cisplatinum as first-line therapy in advanced non-small cell lung carcinoma: a phase study[J]. Anticancer Res, 2004, 24(2): 1239.

[9]王琳, 高姗, 张瑞, 等. JNK通路及HSP70在热化疗抑制人小细胞肺癌细胞生长中的作用[J]. 第二军医大学学报, 2008, 29(2): 142.

[10]Salehi A H, Morris S J, Ho W C, et al. AEG3482 is an anti-apoptotic compound that inhibits JUN kinase activity and cell death through induced expression of heat shock protein 70[J]. Chem Biol, 2006, 13(2): 213.

[11]Ming G G, Qi Z, Jian Z D, et al. Histological complete response to a combined docetaxel/cisplatin/fluorouracil neoadjuvant chemotherapy for T4 stage gastric adenocarcinoma[J]. World J Surg Oncol, 2014, 12(15): 1.

[12]骆海军, 李丽丽, 李伟, 等. DNA修复相关基因甲基化与肺癌A549细胞顺铂化疗耐药的相关性研究[J]. 中华实用诊断与治疗杂志, 2014, 28(2): 122.

[13]Jahanzeb M, Sarna G, Hirsch R, et al. Docetaxel and cisplatinum as first-line therapy in advanced non-small cell lung carcinoma: a phase study[J]. Anticancer Res, 2004, 24(2): 1239.

Influence of docetaxel combined with platinum on expression of HSP70 in lung cancer A549 cells

LIU Li1, YUAN Hong2, MA Ling1, SHAN Li1

(1.DepartmentofPulmonaryMedicine,AffiliatedCancerHospitalofXinjiangMedicalUniversity; 2.Departmentofrespiratory,TheNO.474ChinesePeople′sLiberationArmyHospital,Urumchi,Xinjiang, 830011)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the influence of docetaxel combined with platinum on the expression of heat shock protein 70 (HSP70) in human lung cancer cell line (A549 cells). MethodsLung cancer A549 cells were in-vitro cultured and treated with docetaxel 20 μg/mL (docetaxel group), platinum 5 μg/mL (platinum group) and docetaxel combined with platinum (combination group), respectively, and control group without drug treatment was established. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) was used to detect the activity of A549 cell proliferation and Western Blot to detect the changes of HSP70 expression after treated with docetaxel, platinum and docetaxel combined with platinum, respectively. ResultsMTT method showed that after treatment, cell proliferation was evidently inhibited in all groups and cell activity was markedly lower than control group (P<0.01), and combination group was prominently lower than docetaxel group and platinum group in cell activity (P<0.01). Western Blot results indicated that HSP70 expression decreased obviously in all groups (P<0.05,P<0.01), and was notably lower in combination group than in other two groups (P<0.05). ConclusionBoth docetaxel and platinum can inhibit the proliferation of lung cancer A549 cells, and their combined application has synergetic action, whose mechanism is in association with the down-regulation of HSP70 expression.

KEYWORDS:docetaxel; platinum; heat shock protein 70; A549 cells

通信作者:单莉, E-mail: 19834895@qq.com

基金项目:新疆医科大学科研创新基金XJC201031

收稿日期:2015-01-04

中图分类号:R 734.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)17-048-03

DOI:10.7619/jcmp.201517015