5-aza-cdr对低氧预适应神经细胞NG108的DNMTs表达的影响*

孙明英　张柱霞　杨　洁　姜树原　王光丽　张颜波　邵　国

(1.包头医学院中心实验室生物医学研究中心，内蒙古 包头　014010；2.包头医学院基础医学院，内蒙古 包头　014010；3.丽水学院医学院，浙江 丽水　323000； 4. 泰山医学院附属医院神经内科，山东 泰安 　271000)

5-aza-cdr对低氧预适应神经细胞NG108的DNMTs表达的影响*

孙明英1，2张柱霞1，2杨洁1，2姜树原1王光丽2张颜波4邵国1，2

(1.包头医学院中心实验室生物医学研究中心，内蒙古 包头014010；2.包头医学院基础医学院，内蒙古 包头014010；3.丽水学院医学院，浙江 丽水323000； 4. 泰山医学院附属医院神经内科，山东 泰安 271000)

摘要：目的观察低氧预适应和DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)抑制剂5-氮-2′脱氧胞苷(5-aza-2′deoxycytidine，5-aza-cdR)对神经细胞系NG108-15的DNMTs表达的影响，研究DNA甲基转移酶抑制剂对重复低氧NG08-15细胞的神经保护作用的可能分子机制。方法NG08-15细胞随机分为药物处理组(5-aza-cdR)和正常组(control)，每组又分为C组(未低氧)、H组(1%低氧处理8 h)和HP组(1%低氧/21%复氧4个循环后1%低氧预处理后低氧8h)处理，5-aza-cdR 的浓度为10.0μM，Q-PCR检测DNMTs mRNA的表达。结果C，H和HP的DNMT1在5-aza-cdR和control组内和组间无显著性变化；在control组中，HP较H的DNMT3A mRNA表达降低(P<0.05)，HP较C的DNMT3B mRNA降低(P<0.05)；5-aza-cdR组中，H较C和HP的DNMT3B mRNA降低(P<0.05)；HP的DNMT3B mRNA在5-aza-cdR组和control组之间有差异(P<0.05)。结论单纯低氧预适应可以使DNMT3A和DNMT3B mRNA表达降低， 5-aza-cdR+低氧预适应可以影响DNMT3BmRNA的表达。

关键词：低氧预适应；NG108-15细胞；5-氮-2′脱氧胞苷；DNA甲基转移酶

DNA甲基化是表观遗传学的主要机制之一，是指在配子形成、胚胎发育和躯体组织发育过程中，通过DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT) 催化，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基的5-C端上，形成专一DNA甲基化模式[1]。DNA甲基化可以通过改变基因启动子区的甲基化状态而改变基因表达等复杂的过程[2，3]，低氧预适应通过细胞内源性保护机制以拮抗急性缺血缺氧造成的神经损伤[4，5]。DNA甲基化在低氧耐受过程中可能扮演了重要角色[6]。

5-氮-2’脱氧胞苷(5-aza-2′deoxycytidine，5-aza-cdR) 是一种核苷酸类似物，能抑制甲基化转移酶活性，因而广泛应用于表观遗传学研究中〗[7]。先前研究表明低氧预适应对小鼠海马脑区DNMTs表达产生影响，本实验以小鼠神经杂交瘤细胞NG108-15作为低氧模型，对其加入5-zaz-cdR后探究低氧和5-zaz-cdR联合应用对DNMTs表达的影响，从而为DNA甲基化在低氧预适应神经保护中的可能分子机制进行探索。

1 材料与方法

1.1细胞

小鼠神经细胞系NG108-15购于北京协和医学院细胞中心。

1.2试剂

DMEM高糖培养基购与GIBCO公司，胎牛血清购于四季青公司，Trizol购于Invitrogen公司，real-time PCR Mix 购于南京博尔迪公司，PCR试剂盒，DNAmarker，DNA凝胶回收试剂盒购于天根生化科技有限公司，反转录试剂盒购于invitrogen公司，其余试剂为国产试剂。

1.3仪器

恒温CO2培养箱，台式离心机，恒温水浴锅，微量移液器，一次性注射器，镊子，培养皿，1.5 ml离心管，real-time PCR 为ABI 7900。

1.4 神经细胞NG108-15培养及5-aza-cdR处理

用含HTA的10%胎牛血清的DMEM培养基培养小鼠神经细胞NG108-15，培养箱培养条件为 37 ℃和5% CO2。处理细胞时氧气的终浓度为1%O2，NG08-15细胞随机分为药物处理组(5-aza-cdR)和正常组(control)、每组又分为C组(未低氧)、H组(1%低氧处理8h)和HP组(1%低氧/21%复氧4个循环后1%低氧预处理后低氧8h)处理。

1.5 神经细胞NG108-15处理后的DNMTs及Reelin mRNA的Q-PCR检测

按照Trizol说明书提取经5-aza-cdR和未经5-aza-cdR分别处理的神经细胞NG108-15的RNA，根据invitrogen公司的superscript III的说明书合成20 μl cDNA，利用下列引物对相关基因进行Q-PCR检测。

Q-PCR的条件与先前发表文章相同[6]。Q-PCR结果利用ΔΔCT法进行分析，ΔCT=CT目标基因-CTbeta-actin,mRNA相对丰度值F=ΔΔCT=2-ΔCT。

1.6 统计学处理

2结果

5-aza-cdR处理对低氧预适应神经细胞NG108-15中DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)mRNA表达的影响

通过real-time PCR分析经处理后的神经细胞NG108-15中DNMT1、DNMT3A及DNMT3B mRNA表达情况, 它们的mRNA/beta-actin mRNA的相对丰度表示 (图1 A、B、C)。DNMT1 control组：(C，H，HP)的相对丰度分别为0.0003±0.0002、0.0002±0.000006和0.00025±0.00001，5-aza-cdR组：(C，H，HP)相对丰度分别为0.0001±0.00004，0.0002±0.00002，0.00007±0.00001；DNMT3A control组：(C，H，HP)的相对丰度分别为0.0128+0.0033，0.0181+0.0033，0.01150+0.0032，5-aza-cdR组：(C，H，HP)的相对丰度分别为；0.0102+0.0022，0.0094+0.0015，0.0107+0.0033；DNMT3B control组：(C，H，HP)相对丰度分别为0.00007±0.000008，0.00008±0.00004，0.00004±0.000006，5-aza-cdR组：(C，H，HP)相对丰度分别为0.00006±0.00003，0.00004±0.000003，0.00004±0.000003。

图1　DNMTs mRNA 行对丰度 (β-actin as control)

aP<0.05 vs. H in control group;bP<0.05 vs. C in control group;cP<0.05 vs. C and HP in 5-aza-cdR group;bP<0.05 vs. HP between control and 5-aza-cdR group

DNMT1 在Control组和5-aza-cdR组组间及组内均未发现显著性变化。Control 组DNMT3A mRNA 的HP 较H 表达降低(P<0.05)，DNMT3B mRNA 的HP 较C表达降低(P<0.05)表达降低。5-aza-cdR组中，H较C和HP的DNMT3B在降低(P<0.05)；HP的DNMT3B mRNA在5-aza-cdR组和control组之间有差异(P<0.05)。

3 讨论

先前研究表明，低氧预适应对神经细胞起到保护的作用，低氧预适应可以影响海马脑区DNMTs的表达[6]，我们先前研究显示低氧预适应能够在短时间内增加小鼠学习记忆能力[8]。DNA甲基转移酶的表达改变可以延迟缺血对大脑损伤[9]，研究显示DNA甲基化参与了学习和记忆的形成[10]。我们通过小鼠侧脑室注射5-aza-cdR(DNMT的抑制剂)发现可以增加小鼠空间学习记忆(投稿已接受)，为了进一步明确DNA甲基化在其中的作用，本研究利用体外培养神经细胞观察低氧预适应及低氧预适应+5-aza-cdR对DNMTs表达的影响。

本研究显示低氧预适应没有改变DNMT1的表达变化，低氧预适应可以降低DNMT3A和DNMT3B的表达。研究结果与我们先前报道的体内实验结果相吻合[6]。低氧预适应+5-aza-cdR处理较单纯低氧预适应可以使DNMT3B表达发生变化。研究报道，5-aza-cdR除了具有去甲基化功能外，还可以引起细胞周期阻滞、细胞分化及细胞死亡[11]。5-aza-cdR作为脱甲基化成分，将其插入到DNA分子中，以不可逆的共价方式连接到DNMTs上，抑制DNMTs的活性，影响了甲基化状态[12]。

低氧是导致器官损伤的主要原因之一[13，14]，新生儿期，急性低氧能够引起缺血缺氧脑病、神经认知功能障碍、癫痫及大脑麻痹等[15]。先前研究表明，低氧预适应可能通过DNMTs表达和活力发挥神经保护作用[6]，因此，我们可以推测5-aza-cdR与低氧预适应联合后，也通过调节DNMTs表达而发挥神经保护作用。

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The effects of 5-aza-2’-deoxycytidine on the expression of DNMTs in hypoxic preconditioning NG108-15 cells

SUNMing-ying1,2ZHANGZhu-xia1,2YANGJie1,2JIANGShu-yuan1WANGGuang-li3ZHANGYan-bo4SHAOGuo1,2

(1.Biomedicine research center of center lab, BaoTou medical college,Baotou 014010，China2.Basci medical department, Baotou medical college, BaoTou 014060，China; 3. Medical school, Lishui University, Lishui 323000，China;4.Dept. of Neurology，Affiliated Hospital of Taishan Medical College, Taian 271000,China)

Abstract:Objective: The aim of this study was to observe the effects of 5 -aza -2’-deoxycytidine on the DNMTs expression in nerval cell line NG108-15 which repeatedly exposed to autoprogressive hypoxia and to investigate the possible neuroprotection mechanism in it. Methods: NG108-15 cells were divided into 5-aza-cdR(10.0 μmol/L) group and control group. Each group were treated with hypoxic(H)，hypoxic preconditioning(HP) and no hypoxia(C). The mRNA levels of DNMTs were analyzed by QPCR. Results: DNMT1 was not found difference between 5-aza-cdR treatment group and control group. Hypoxia preconditioning treatment can change the expression of DNMT3A and DNMT3B in control group. The DNMT3A mRNA of HP group(P<0.05 vs H)and the DNMT3B mRNA of HP (P<0.05 vs C)in control group . DNMT3B mRNA of H was found to be decreased in 5-aza-cdR(P<0.05 vs H and C)；DNMT3B mRNA of HP was different between the 5-aza-cdR group and control group(P<0.05). Conclusion: Hypoxic preconditioning can change the expression of DNMT3A and DNMT3B mRNA. Hypoxic preconditioning combined with 5-aza-cdR can affect the expreesion of DNMT3B mRNA.

Key words:hypoxic preconditioning; NG108-15 cell line;5-aza-2’-deoxycytidine; DNA methyltransferase

(收稿日期2015-10-8)

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2015.12.001

中图分类号：R730.23

文献标识码：A

文章编号：1004-7115(2015)12-1321-03

通讯作者：邵国，电话：0472-7167890，E-mail：shao_guo_china@163.com。

作者简介：孙明英(1990—)，女，硕士，主要研究方向：生物化学和分子生物学专业。

基金项目：国家自然科学基金(81060212, 81160244,81360316，81460283)；内蒙古自然科学基金资助项目(2010BS1104；2014MS0810)；中国博士后基金项目(20080430851)；内蒙古自治区高等学校青年科技英才支持计划资助(NJYT-13-A10)；研究生科研创新项目[S201410127(Y02)]；教育部留学回国人员科研启动基金(46批)。对本研究由相同贡献。