舞毒蛾羧酸酯酶最佳反应体系的确立1)

付莉 胡春祥

(黔南州林业种苗站，黔南州，558000) (东北林业大学)

责任编辑:程 红。

舞毒蛾(Lymantria dispar)是一种杂食性食叶害虫，其寄主包括杨、柳、桑、苹果、柿、梨、桃和杏等500多种植物，分布于亚洲(日本、中国、朝鲜)、欧洲和北美洲，在我国主要分布于东北、华北、西北、华东、华中、华南和西南等地区［1-2］。

羧酸酯酶(CarE)是酯酶家族中的一种重要水解酶，在有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯类农药的抗性形成中起重要作用［3-4］。目前，CarE 的测定方法虽然已经很成熟，但不同来源的CarE 最适测定条件存在差异，而舞毒蛾CarE 活性最佳反应体系未有报道。本研究旨在通过正交试验设计确定舞毒蛾CarE 最适反应条件，为深入研究舞毒蛾CarE 生物化学特性以及CarE 介导的杀虫剂抗药性形成机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

舞毒蛾幼虫采集于东北林业大学实验林场内，幼虫采用健康无污染的成年白桦(Betula platyphylla)叶片饲养，每天定时观察并更换新鲜树叶，将排泄物和食物残渣及时清除。挑取健康、大小一致的3 龄幼虫用于试验。

1.2 主要试剂

固蓝B 盐、毒扁豆碱、十二烷基硫酸钠(SDS)购自Sigma 公司，α-乙酸萘酯(α-NA)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、牛血清白蛋白均购自天津永大化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.3 主要仪器设备

制冰机(日本SNAYO)、电子天平(美国奥豪斯Explorer Pro)、微量移液器(上海大龙医疗设备有限公司)、D-37520 冷冻离心机(德国Sorvall，biofuge stratos)、电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)、TU-1901 双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.4 酶液制备

随机挑取健康、大小一致的舞毒蛾3 龄幼虫，依照表1中的酶液浓度，用预冷的不同pH 值的0.04 mol·L-1磷酸缓冲液作为提取液，充分冰浴匀浆后，于4 ℃、10 000 r·min-1离心15 min，取上清液作为原酶液。

1.5 CarE 活性测定

CarE 活性测定参照Van Asperen［5］和高希武等［6］的方法，按照正交表L25(56)列出的25 个处理组合，取0.05 mL 待测酶液，加入1.8 mL 不同浓度的底物α-乙酸萘酯(含毒扁豆碱1 ∶1)，0.45 mL 不同pH 值的磷酸缓冲液，在恒定温度下水浴反应10、15、20、25、30 min 后加入0.9 mL 显色剂(V(1%固蓝B 盐)∶V(5%十二烷基硫酸钠)=2 ∶5，应用前混合而成)终止反应，用分光光度计在600 nm 波长下测定光密度OD 值，通过α-萘酚标准曲线求出反应生成的α-萘酚的量。

CarE 比活力(μmol·min-1·mg-1)= W/T×P。式中:W 为生成的α-萘酚的量(μmol);T 为反应时间(min);P 为蛋白质质量(mg)。

1.6 蛋白质质量测定

参照Bradford［7］考马斯亮蓝G-250 方法。

1.7 正交试验设计

设置酶浓度、底物浓度、pH、反应温度、反应时间5 个因素，每个因素选取5 个水平，进行L25(56)的正交试验，具体组合见表1。

表1 舞毒蛾CarE 最佳反应体系的正交设计

2 结果与分析

2.1 舞毒蛾CarE 比活力

不同处理组合间的舞毒蛾CarE 比活力不同，比活力最小的为0.105 7 μmol·min-1·mg-1，最大的为0.418 7 μmol·min-1·mg-1，为最小比活力的3.96 倍(表2)。

表2 不同处理组合下舞毒蛾CarE 比活力

2.2 正交试验极差分析和方差分析结果

由表3、表4可见，影响舞毒蛾CarE 比活力大小的因子由强到弱依次为酶浓度、pH 值、反应时间、反应温度、底物浓度，且5 个因素对舞毒蛾CarE 比活力影响均极显著。综合极差分析和方差分析结果，5 个因素对测定舞毒蛾CarE 比活力均有显著影响，因此在测定时应加以控制。选择各因素的最优水平，可得到测定舞毒蛾CarE 比活力的最佳条件组合为A1B2C4D5E1，即:酶浓度0.2 头·mL-1，底物浓度0.2 mmol·L-1，pH=7.5，温度45 ℃，反应时间10 min。该组合测定舞毒蛾CarE 比活力体系最佳，CarE 催化能力最强，比活力最大。

表3 正交试验极差分析结果

表4 正交试验方差分析结果

3 结论与讨论

有关CarE 测定方法的报道中，来自不同的物种的CarE 活性测定最适条件均有不同。柳琼友等［8］测定了烟草甲(Lasioderma serricorne)成虫CarE 活性测定的最适条件为:酶浓度为1 头·mL-1、底物浓度为0.5 mmol·L-1、pH=7.5、反应温度为42 ℃、反应时间为10 min。魏绪强等［9］测定德国小蠊(Blattella germanica)CarE 活性的最佳条件为:酶浓度为0.35只·mL-1、底物浓度为0.6 mmol·L-1、反应时间为5 min、反应温度为40 ℃、pH=6.5。刁青云等［10］测定了意大利蜜蜂(Apis mellifera)CarE 活性的最佳条件为:酶浓度为每毫升0.3 个腹部、底物浓度为0.4 mmol·L-1、pH=7.0、反应温度为35 ℃、反应时间为10 min。

本研究结果表明，舞毒蛾CarE 活性反应条件中5 个因素均对测定有显著的影响，影响舞毒蛾CarE比活力大小的因子由强到弱依次为酶浓度、pH 值、反应时间、反应温度、底物浓度，最佳反应条件组合为:酶浓度0.2 头·mL-1，底物浓度0.2 mmol·L-1，pH=7.5，反应温度45 ℃，反应时间10 min。研究结果为进一步研究舞毒蛾羧酸酯酶生化特性奠定基础。

［1］ 张浩，陈乃中，李正西.中国舞毒蛾六个地理种群的RAPD 分析及SCAR 标记构建［J］.昆虫学报，2011，54(6):714-721.

［2］ 侯雅琴，南楠，李镇宇.舞毒蛾研究进展［J］.河北林果研究，2009，24(4):439-444.

［3］ 吴精晶，牛金志，豆威，等.昆虫羧酸酯酶研究进展［C］//公共植保与绿色防控.鹤壁:中国植物保护学会，2010:370-373.

［4］ 郭晶，高菊芳，唐振华.羧酸酯酶及其在含酯类化合物代谢中的作用［J］.农药，2007，46(6):365-368，381.

［5］ Van Asperen K.A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method［J］.Journal of Insect Physiology，1962，8(4):401-416.

［6］ 高希武，郑炳宗.几种农药对蚜虫羧酸酯酶的抑制和拟除虫菊酯的增效［J］.北京农业大学学报，1991，17(4):89-94.

［7］ Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］.Analytical Biochemistory，1976，72(1/2):248-254.

［8］ 柳琼友，陈文龙，顾丁，等.正交试验法确定烟草甲成虫羧酸酯酶反应的最适条件［J］.西南师范大学学报:自然科学版，2011，36(3):150-155.

［9］ 魏绪强，钱坤，曾晓，等.利用正交试验法建立德国小蠊羧酸酯酶的最佳反应体系［J］.中国媒介生物学及控制杂志，2008，19(4):294-297.

［10］ 刁青云，姜秋玲，张楠，等.蜜蜂羧酸酯酶最适反应条件的测定方法［C］//2006年全国蜂产品市场信息交流会论文集.重庆:中国养蜂学会、中国蜂产品协会，2006:69-72.