大肠可利用越橘成分抑制人结直肠癌细胞生长的机制研究

李国东　金俊超　张津宁　林罗强　刘明

·论著·

大肠可利用越橘成分抑制人结直肠癌细胞生长的机制研究

李国东金俊超张津宁林罗强刘明

【摘要】目的利用植物化学物(phytochemicals)中的越橘提取物，制备大肠可利用越橘提取物(Colon-available cranberry extract，CACE)，并以此观察CACE对H2O2诱导的DNA损伤的保护作用；并研究 CACE对人大肠癌细胞的增殖和侵袭能力的影响及其分子机制。方法经模拟上消化道环境消化吸收后，将越橘提取物制备成CACE。首先以MTT法检测CACE对大肠癌Lovo细胞的生长抑制作用。然后利用单细胞凝胶电泳实验检测CACE对于过氧化氢诱导的大肠癌细胞核损伤的保护作用；进而用Matrigel基底膜侵袭实验检测CACE对Lovo细胞侵袭能力的影响，并通过流式细胞技术观察CACE对于Lovo细胞周期的影响。最后利用Western-blot方法检测CACE对Lovo细胞P53及VEGF蛋白表达的影响，同时使用实时荧光定量聚合酶链反应方法检测CACE对于Lovo细胞VEGF表达的影响。结果MTT实验结果示：CACE浓度从20μg/ml增至120μg/ml，Lovo 细胞增殖率从90.64±3.11%降至38.54±3.13%。单细胞凝胶电泳实验结果发现：以相同浓度的H2O2损伤Lovo细胞，CACE干预组较对照组的细胞DNA损伤明显减轻，而且随CACE浓度增加损伤进一步减轻。流式细胞仪检测细胞周期结果发现：CACE增加了Lovo细胞在G1期的比例，但没有明显的统计学意义(P>0.05)。穿膜侵袭实验显示：穿膜细胞数量随CACE浓度增加而减少；Western-blot结果：CACE能显著降低大肠癌Lovo细胞P53和VEGF蛋白的表达，且随浓度增加该作用进一步增强；Real-time PCR实验结果显示，CACE抑制了VEGF的mRNA的表达。结论CACE在体外模型中能够显著抑制人大肠癌细胞系Lovo的增殖和侵袭，且对DNA损伤具有保护作用，其作用机制可能是通过抑制P53和VEGF的表达来实现。

【关键词】越橘；中草药；结直肠肿瘤；抑制；分子机制

Research on the molecular mechanisms of colon-available cranberry extract(CACE) inhibiting the growth of colorectal cancer cell

LIGuo-dong，JINJun-chao，ZHANGJin-ning，

LINLuo-qiang.DepartmentofGeneralSurgery，theFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity，Harbin150001，China

Correspondingauthor：LIUMing，Email：mliu35@aliyun.com

【Abstract】ObjectiveIn recent years，phytochemicals as cancer chemopreventive treatment of colorectal cancer have been widespread concerned.In this study，we used cranberry extract，which is one of phytochemicals，to prepare Colon-available cranberry extract(CACE)，and to observe protection effect of CACE on the DNA damage induced by H2O2.The effects of CACE on colorectal cancer cell proliferation and invasive ability were observed.Moreover，the molecular mechanisms of CACE in colorectal cancer cell proliferation and invasion were detected.MethodsBy imitating the environment of upper gastrointestinal tract digestion and absorption，cranberry extract was prepared into CACE.First of all，the effect of CACE on growth inhibition was detected in colorectal cancer Lovo cell line determined by the MTT methood.Single cell gel electrophoresis experiment was used to test the protective effects of nucleus by CACE in colorectal cancer cells induced by hydrogen peroxide damage.Next，the Matrigel basement membrane invasion experiment was carried to exam CACE influence on Lovo cell invasive ability.Flow cytometry technique was also used to observe the influence of CACE on Lovo cell cycle.Western blot was further used to detect CACE impact on Lovo cell P53 and VEGF protein expression.Meanwhile，real-time fluorescent quantitative PCR method was used to detect CACE VEGF expression in Lovo cells.ResultsThe MTT experiment results showed that，with

作者单位：150001 哈尔滨医科大学附属第四医院普外科 普外科生物样本库

CACE concentr ation increasing from 20 ug/ml to 120 ug/ml，proliferation rate of Lovo cells falls from 90.64±3.11% to 38.54±3.13%.Single cell gel electrophoresis experiment showed that DNA damage of Lovo cells significantly reduces in the CACE intervention group compared to the control group after the cells were damaged with the same concentration of H2O2.Moreover，with increase in the CACE concentration the damage further reduced.The cell cycle was identified by Flow cytometry，and the results showed that CACE increased the proportion of Lovo cells in G1 phase.However，there was no discernible statistical significance(P>0.05).The Matrigel basement membrane invasion experiment showed that membrane cells reduced with the increase of concentration of CACE.CACE can significantly reduce the expression of colorectal cancer Lovo cells P53 and VEGF protein by Western blot results.With the increasing of concentration，the effect was further strengthened.The Real-time PCR experimental results showed that CACE inhibits VEGF mRNA expression.ConclusionThe CACE can significantly inhibit the proliferation and invasion of colorectal cancer in Lovo cell line，and CACE plays a protective role in DNA damage.The anti-proliferation mechanisms of CACE may be through inhibiting the expression of P53 and VEGF.

【Key words】Vaccinium vitis-idaea；Drugs，chinese herbal；Colorectal neoplasms；Inhibition；Molecular mechanism

结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁我国及世界人民的健康和生命。近年，结肠癌全球发病率逐年增长，已跃居全球肿瘤发病率第3～5位[1-2]。最近几年，CRC的研究和治疗虽然取得了可喜的进展，众多分子通路均被发现参与其发生、发展，但其治疗效果并未显著改善[3-4]。因此，发现并进一步寻找并确定CRC早期干预靶点是目前研究的主要目标之一。

植物化学物(phytochemicals)由种类繁多的化学物质组成，根据其代谢产物的产生过程将代谢产物分为初级代谢产物和次级代谢产物。科学实验已经证实植物化学物质对于癌症具有抑制作用[5]，但是对于其代谢产物的抗癌效果及机制很少报道。越橘(cranberry)是极好的健康食品之一，具有很强的抗氧化作用，研究表明，越橘中含有大量的酚类物质，其中以类黄酮含量最高，而类黄酮具有抗氧化、抗癌的作用。本研究将越橘提取物制备成“大肠可利用的越橘提取物(CACE)”，并进一步探索此类物质的抗癌效果及机制。

材料和方法

一、大肠可利用越橘提取物(CACE)的制备

称取100 mg越橘提取物(购自西安天一生物技术有限公司)，用PBS定容至20 ml，加入人胃蛋白酶(Sigma Chem.Co.Ltd)终浓度为315 units/ml，37℃ 水浴摇床孵育；加入4.5 ml 胰酶(4 mg/ml)和胆盐(25 mg/ml)混合物；用Parafilm 封口膜封住瓶口，37℃孵育2 小时，透析瓶外面的溶液代表可以达到结肠被大肠可利用的部分，收集后13，000 rpm 离心，保存于4℃冰箱备用。

二、方法

1.MTT检测：实验孔加入终浓度分为20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml 、80 μg/ml、120 μg/ml的CACE及80 μg/ml的越橘提取物，每种浓度设3孔重复，用含10%胎牛血清的培养液对照分别培养48 h和72 h；选择490 nm波长，在酶标分光光度计上检测各孔的吸光度，计算抑制率，绘制生长曲线。

2.Matrigel穿膜侵袭实验：按要求将matrigel 4℃过夜变成液态；用无血清的冷细胞培养基按1∶3稀释，混匀，加入上室，每室50 μl；室温下孵育一个小时；将对数期生长的大肠癌Lovo细胞，离心弃去培养液，用PBS洗1~2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1~10×105。取细胞悬液加入上室，每室200 μl；培养24小时，风干，0.1%结晶紫染色，计数，统计结果。

3.彗星试验：取对数生长期细胞，以1.25 ×105/ml密度接种于T-25培养瓶中，24 h后加入H2O2(75 μmol/ml)、H2O2(75 μmol/ml)与CACE(40 μg/ml、80 μg/ml、120 μg/ml)混合液、H2O2(75 μmol/ml)与CACE(80 μg/ml)混合液，培养24 h，收集细胞备用，将0.5%正常熔点的琼脂糖100 μl滴于磨砂玻片面，迅速盖上盖玻片，4°C下凝固；将37°C 0.5%低熔点琼脂糖100 μl+10 μl细胞悬液(H2O2处理、H2O2与CACE联合应用处理、H2O2与越橘提取物联合应用处理)混匀，迅速铺于第一层胶上，盖片，移入冰箱使其固化，将玻片缓缓浸入新鲜配制的冰凉细胞溶解液中1.5 h。取出后，放入水平电泳槽中，倒入新鲜配制的冰冷电泳缓冲应用液恒压25 V，300 mA电泳25分钟，凉干，荧光染料染色。结果使用FISH3.0拍摄(X40倍)照片，用CASP彗星图像分析软件进行分析各图片。

4.细胞周期分析：取对数期生长细胞，常规消化制成单细胞悬液，以1.25 ×105/ml密度接种于T-25 培养瓶中，24 h后加入不同浓度CACE及越橘提取物(80 μg/ml)培养24 h，收集所有细胞，清洗、固定、染液，计数10000个细胞，流式细胞仪检测细胞周期时相情况。

5.Western-blot检测：将使用不同浓度的CACE及越橘提取物(80 μg/ml)处理过的细胞裂解提取蛋白，测定样品蛋白浓度，取相同蛋白含量的样品，用SDS-PAGE凝胶电泳分离，转移至硝酸纤维素膜，封闭后加入一抗，二抗，DAB显色。结果使用imageJ 进行灰度分析。

6.Real-time PCR检测：将对数期生长的细胞加入不同浓度的CACE及越橘提取物(80 μg/ml)联合培养24 h后Trizol法提取总RNA，逆转录成cDNA，引物探针由上海生工生物有限公司合成。VEGF上游引物：5’CTTGCCTTGCTGCTCTAC3’；下游引物reverse：5’GATGTCCACCAGGGTCTC3’。内参为GAPDH。PCR反应体系及条件参照SYBR Premix Ex Taq 说明书，结果应用SPSS13.0统计软件对所得数据进行统计学处理。

结果

一、MTT实验结果

利用MTT法检测CACE抑制大肠癌细胞系Lovo生长呈剂量反应关系(图1~2)。混合培养24小时，20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml、120 μg/ml组以及越橘提取物80 μg/ml组的大肠癌细胞OD值分别为0.91±0.03、0.76±0.04、0.50±0.08、0.47±0.02、0.41±0.03、0.43±0.05；抑制率分别为9.36±3.11%、25±4.17%、52.08±8.33%、55.21±2.09%、61.46±3.13%、59.37±5.21%。混合培养48小时，20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml组大肠癌细胞OD值分别为0.75±0.04、0.56±0.03、0.31±0.06、0.25±0.01、0.21±0.04、0.19±0.07；抑制率分别为26.04±4.17%、45.83±3.11%、71.87±6.26%、78.12±1.05%、82.29±4.17%、84.37±7.29%。结果使用SPSS V13.0软件进行统计学处理，不同浓度组间的差别有统计学意义(P<0.05)。

注：*为越橘提取物的浓度图1　Lovo细胞OD值量化图，可见以不同浓度的CACE及越橘提取物作用Lovo细胞，24、48小时后用酶标仪测定各浓度组细胞OD值的变化随CACE浓度的增加而逐渐降低，说明细胞的增殖数量随CACE浓度的增加而逐渐降低；图2　Lovo细胞生长抑制图，可见不同浓度的CACE及越橘提取物作用24、48小时后对Lovo细胞抑制率随CACE浓度的增加而逐渐增强

二、Matrigel 穿膜侵袭实验结果

穿膜细胞数随CACE浓度增加而减少，细胞培养24 h后在X400光镜下计数膜背面侵袭的细胞数(图3~4)，0、40 μg/ml、80 μg/ml、120 μg/ml及80 μg/ml越橘提取物组穿膜细胞数分别为25±2.5495、10.2±4.8683、10±1.2247、6.8±0.8367、5.2±0.9635结果使用SPSS V13.0软件进行统计学处理，不同浓度组间的差别有统计学意义(P<0.05)。

注：*为越橘提取物浓度；a图为空白组；b图为CACE 40μg/ml；c图为CACE 80μg/ml；d图为CACE 120μg/ml；e图为越橘提取物80μg/ml图3　细胞侵袭实验显微镜下图像(×400)，可见以不同浓度的CACE(0、40、80、120μg/ml)及越橘提取物(80μg/ml)处理Lovo细胞，24小时后制备细胞悬液5×105，加入上室(200μg/室)，24孔板下室加入10%胎牛备清的培养液(500μg/室)，培养24小时后计数基底膜背面侵袭的细胞数;图4　CACE浓度与实测侵袭细胞数的曲线图像，可见不同剂量的CACE及越橘提取物作用Lovo细胞24小时后，于×400光镜下计数基底膜背面侵袭的细胞数，随机计数中间和四周共5个视野，求出其平均值，实验重复3次

三、彗星试验结果

H2O2、H2O2与CACE混合应用对Lovo细胞系处理后，经彗星实验检测表明，75 μmol/ml的H2O2处理Lovo细胞系后，尾矩值和Olive尾矩值分别为79.83±30.64、52.15±14.703(与对照组比，P<0.05)，说明H2O2对DNA具有损伤作用。二者联合应用后：CACE+ H2O2组(40μg/ml+75μmol/ml)，尾矩值和Olive尾矩值分别为70.95±13.23、49.62±7.30(与H2O2组比，P>0.05)；CACE+ H2O2组(80μg/ml+75μmol/ml)，尾矩值和Olive尾矩值分别为28.66±5.26、30.18±4.20(H2O2组比，P<0.05)；CACE+H2O2组(120 μg/ml+75 μmol/ml)尾矩值和Olive尾矩值分别为20.81±11.11、22.28±7.98(与H2O2组比，P<0.05)；越橘提取物+ H2O2组(80 μg/ml+75 μmol/ml)尾矩值和Olive尾矩值分别为22.74±10.68、24.63±8.23(与H2O2组比，P<0.05)。表明CACE与越橘提取物能减少H2O2对人结肠癌Lovo细胞损伤，且CACE减少DNA 的损伤有浓度依赖趋势(图5，表1)。

注：a图为对照组；b图为越橘提物(80 μg/ml)+H2O2组;c图为CACE(120 μg/ml)+H2O2组;d图为CACE(80 μg/ml)+H2O2组;e图为CACE(40 μg/ml)+H2O2组;f图为 H2O2组图5　Lovo细胸慧星实验图(FISH 3.0拍摄)可见空白对照组没有DNA损伤；H2O2组DNA损伤最重，慧尾亮度最高；加入CACE后相同浓度H2O2对DNA的损伤明显减轻，且CACE浓度增加损伤进一步减轻，慧尾减小、亮物变低。

表1　CASP彗星图像分析软件对各组的彗星图像进行分析结果

注：与对照组比较，a为P<0.05；与H2O2组比较，b为P<0.05；与CACE+ H2O2组(80μg/ml+75μmol/ml)比较，c为P<0.05。

注：*为越橘提取物的浓度图6　越橘提取物及不同浓度组CACE对P53及VEGF蛋白表达的影响免疫印迹图；图7　不同浓度组的CACE对P53表达差异免疫印迹量化图；图8　不同浓度组的CACE与VEGF蛋白表达差异免疫印迹量化图。

四、流式细胞仪检测细胞周期

不同浓度CACE(0、40 μg/ml、80 μg/ml、120 μg/ml)及 80 μg/ml越橘提取物培养24h，以流式细胞仪检测细胞周期时相情况：G1期细胞比例分别为61.77±7.04%、63.66±8.35%、66.68±7.13%、67.85±6.51%、65.50±6.91%、；G2期细胞比例分别为7.25±4.22%、6.78±3.90%、7.44±2.46%、9.03±0.98%、15.23±10.55%；S期细胞比例分别为30.98±4.96%、29.56±5.01%、25.87±4.88%、23.12±5.53%、19.27±6.61%。越橘提取物组与空白组无统计学差异；G1 期细胞比例随CACE浓度增加而增加，S期细胞比例随CACE浓度增加逐渐下降，但各组间比较无统计学差异，说明越橘提取物与CACE对Lovo细胞的周期无明显影响。

五、Western-blot结果

CACE组及越橘提取物处理24小时的Lovo细胞系，VEGF及P53蛋白的表达均有所降低，且 CACE组中，随着浓度的增加其作用逐渐增强。结果如图6~8所示。

六、荧光定量PCR结果

VEGF表达量随CACE浓度的增加而降低，与对照组比较，P<0.05，说明CACE在40~120 μg/ml之间能够抑制VEGF的表达。各处理组间虽有随CACE浓度增加VEGF表达有减少趋势，但统计学分析，P>0.05说明无明显浓度依赖性(图9)。

图9　不同浓度的CACE对VEGF表达的抑制作用实时定量PCR图

讨论

越橘的应用已有多年的历史，但随着近年来对越橘研究的不断增多，其广泛的抗肿瘤作用才逐渐受到关注。越橘属植物中分离鉴定的化学成分主要为黄酮类、萜类等物质。黄酮类化合物主要包括花色苷、黄酮醇和槲皮素类成分，黄酮类成分为本属植物的主要活性成分。众多试验研究说明越橘具有抗癌防癌功能，包括胃癌、肠癌等消化道肿瘤。一般认为越橘具有抗癌的作用主要与其含有原花青素有关。最近的一项研究结果提示，越橘的抗癌作用还与其他酚类或非酚类成分有关[6]。但由于没有考虑到消化道对越橘提取物的消化和吸收，可能会引起对越橘提取物作用的评价有所偏差。本试验为了尽可能减少这种偏差，我们在体外模拟消化道环境，将越橘提取物制备成大肠可利用的物质。虽然，这种模拟的消化过程并不能真正代表人类的消化道，比如整个消化道的长度、蠕动及复杂的酶系统等，也不能模拟胃肠的微生物环境。但是我们模拟了胃和小肠的关键消化过程对越橘提取物的作用，比以往的研究更加真实的反映了越橘化学预防作用。为越橘进入临床研究打下了坚实的基础。

癌症的发生是一个多阶段过程，植物化学物几乎可以在每一个阶段抑制肿瘤的发生。自由基是生物体内活性较高的物质，特点是反应无专一性，几乎与生物体内所有物质如糖类、蛋白质、DNA、碱基、磷脂和有机酸等都能反应，且反应速率快，人体内的每一个细胞都会受到过多的氧自由基伤害，如果这种损伤不能及时得到修复，长此下去就会导致组织和器官功能失常，从而出现各种疾病，氧自由基攻击细胞的DNA，导致基因突变，从而成为癌变的基础；还有很多化学性的致癌物质，在体内也可以转变为氧自由基，作用于细胞、组织，使它们发生癌变。一直以来，研究者们把工作重点放在了水果中的维生素C、维生素E 以及胡萝卜素上，然而酚类复合物和类黄酮才是水果中最主要的抗氧化剂。本实验彗星实验检测表明CACE能减小H2O2对人结肠癌Lovo细胞系造成的DNA 损伤，且有浓度依赖趋势。目前已经发现的清除自由基的机理有两种：一种是增强抗氧化酶活性，迅速消灭自由基，比如超氧化物岐化酶和过氧化氢酶就是存在于人体正常组织当中的清除氧自由基的重要酶系统；另外一种方法是直接摄入抗氧化剂。据报道：蔬菜及水果中的主要的抗氧化物质是多酚类及黄酮类化合物，来源于苹果中的维生素C的抗氧化性仅占总的抗氧化能力的0.4%。实验表明越橘中含有大量的酚类物质，其中以类黄酮含量最高。黄酮类化合物是一类在植物界广泛分布的多酚类天然产物。研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抗心脑血管疾病、抗炎、抗病毒、免疫调节等多种生理功能及药理作用[7]。

肿瘤转移是连续的多步骤的过程，大量研究表明侵袭是贯穿肿瘤转移全过程的重要步骤。我们通过Matrigel 穿膜侵袭实验观察到了CACE对大肠癌细胞侵袭能力的影响。结果表明在40～120 μg/ml之间组穿膜细胞数随CACE浓度增加而减少，说明CACE对大肠癌细胞侵袭能力具有抑制作用，且具有浓度依赖性，但本研究并未发现CACE对Lovo细胞的周期的明显影响。

众多研究表明，VEGF与P53在几乎所有恶性肿瘤组织中都有高度表达，较高的VEGF与P53蛋白的表达反映了高水平的细胞增殖状态。当实体肿瘤处于生长旺盛时期，局部的氧供无法满足肿瘤细胞存活和生长需要，微环境就会缺氧。缺氧能激活多种血管生成相关因子表达[8]，此时新生血管的生成有利于肿瘤细胞的生存并增强其浸润和转移能力，而新生血管形成和血管通透性增加被认为是血管内皮细胞生长因子相关疾病主要发病因素[9]。因此对缺氧的适应和新生血管的形成是恶性肿瘤发展过程的关键步骤。VEGF可以通过诱导内皮细胞分裂、增殖、迁移，促进新生血管的生成和肿瘤细胞的浸润转移，是目前所知的作用最强的促进VEGF表达上调，能使结肠癌组织血管的生成增加，为肿瘤的生长提供更多的营养物质，有利于肿瘤细胞的生长与转移[10]。另有研究显示：VEGF反义核苷酸能够通过降低VEGF基因的表达，抑制人大肠癌HT-29细胞的体外增殖，并对其具有一定的凋亡诱导作用[8]。

本实验结果显示存在于蔓越橘中的植物化学物质通过天然组合，被消化吸收后具有极强的抗氧化性、抑制肿瘤细胞增殖及侵袭转移的活性，并通过一系列体外模型证实了CACE 在大肠癌发生、发展和侵袭等方面的功效，从而阐明了其化学预防机制。本研究将为开发研制天然、绿色抗肿瘤新药开辟广阔的前景。

参考文献

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(本文编辑：马天翼)

李国东，金俊超，张津宁，等.大肠可利用越橘成分抑制人结直肠癌细胞生长的机制研究[J/CD].中华结直肠疾病电子杂志，2015，4(2)：144-150.

(收稿日期：2015-02-11)

通讯作者：刘明，Email： mliu35@aliyun.com

基金项目：国家自然科学基金(81372612)；国家自然科学青年基金(81302059)；黑龙江省留学归国科学基金(LC2013C35)；黑龙江省教育厅面上项目(12541300)；哈尔滨医科大学附属第四医院杰出青年基金

DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2015.02.08