N-乙酰半胱氨酸在缓解氧化应激造成的血管平滑肌细胞损伤和表型转变中的作用

樊明强，张延林，丁　涛，王　莹

(平凉市人民医院心内科，甘肃 平凉 744000)



N-乙酰半胱氨酸在缓解氧化应激造成的血管平滑肌细胞损伤和表型转变中的作用

樊明强※，张延林，丁涛，王莹

(平凉市人民医院心内科，甘肃 平凉 744000)

摘要：目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)在缓解氧化应激诱导血管平滑肌细胞(VSMC)损伤和表型转变中的作用。方法小鼠VSMC(MOVA细胞)常规培养后随机分为4组:对照组、35 μmol/L叔丁基氢过氧化物(t-BHP)处理组、35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC处理组、1 mmol/L NAC处理组。二氯荧光黄二乙酸酯探针检测t-BHP处理后的细胞内活性氧类(ROS)水平。CCK-8试剂盒法检测各组细胞的抑制率，实时荧光定量聚合酶链反应技术与Western blot检测血管平滑肌合成型标志物α-肌动蛋白(SMA)和合成型标志物平滑肌胚胎型肌球蛋白重链(SMemb)的mRNA和蛋白表达，同时分析NAC和t-BHP 处理对miR-145表达的影响。结果35 μmol/L t-BHP处理后，细胞内ROS水平显著增高，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。与35 μmol/L t-BHP处理组相比，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC处理组细胞内的ROS水平降低(P<0.05)。与对照组相比，35 μmol/L t-BHP处理后细胞抑制率、凋亡率增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与35 μmol/L t-BHP 处理组相比，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC处理组细胞抑制率和凋亡率均降低(P<0.05)。与对照组相比，35 μmol/L t-BHP处理后细胞SMA表达降低，SMemb表达增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与35 μmol/L t-BHP处理组相比，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC处理组SMA表达较高，SMemb表达较低(P<0.05)。与对照组相比，35 μmol/L t-BHP处理后miR-145的表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与35 μmol/L t-BHP处理组相比，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC处理组miR-145的表达增加(P<0.05)。结论NAC可以缓解氧化应激诱导的VSMC损伤和表型转变，此过程中伴随miR-145的表达增高。

关键词：N-乙酰半胱氨酸；血管平滑肌细胞；氧化应激；微RNA

动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)是一种血管内壁脂质异常沉积造成的血管硬化[1]。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖和表型转变的异常在As的发生中扮演重要角色，VSMC的增殖/凋亡平衡失调会诱发不稳定斑块的形成[2]。氧化应激过程中增高的活性氧类(reactive oxidative species，ROS)水平是造成VSMC损伤的确定因素，能引起VSMC凋亡等细胞损伤[3]，但是氧化应激能否引起VSMC的表型转变还少有报道。有研究发现，microRNA-145(miR-145)可以抑制VSMC由收缩型转为合成型[4]，因此本研究采用叔丁基氢过氧化物(tert-butyl hydroperoxide，t-BHP)诱导小鼠VSMC(MOVA 细胞株)的氧化应激状态，观察MOVA细胞的增殖变化，通过检测VSMC收缩型标志物平滑肌α-肌动蛋白(smooth muscle actin，SMA)与合成型标志物平滑肌胚胎型肌球蛋白重链(smooth muscle embryonic myosin heavy chain，SMemb)的表达变化，研究氧化应激对MOVAS细胞表型转变的影响，并使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylglucosamine，NAC)进行保护处理，探讨NAC能否缓解氧化应激造成的VSMC损伤及表型改变，并分析miR-145在NAC处理后的表达变化。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器NAC、t-BHP、膜联蛋白-碘化丙啶凋亡检测试剂盒及二氯荧光黄二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescindiacetate，DCFH-DA)荧光探针购自美国Sigma公司。CCK-8(Cell Counting 8)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。DMEM培养基、胎牛血清购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司。RNA提取试剂盒购自美国QIAGEN公司，ImProm-Ⅱ®反转录试剂盒和GO Taq®qPCR Master Mix购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。放射免疫分析蛋白裂解液、双喹啉-4-羧酸二钠盐蛋白定量分析盒、电化学发光显色试剂盒显色购自北京普利莱生物技术公司。兔抗小鼠SMA多克隆抗体、兔抗小鼠SMemb多克隆抗体、兔抗小鼠β-actin多克隆抗体及HRP标记山羊抗兔IgG二抗购自美国SANTA CRUZ公司。仪器：流式细胞仪(FACSCalibur,美国BD公司)、酶联免疫检测仪(HBS-1096B，南京德铁设备有限公司)、荧光分光光度计(F97，上海精密仪器仪表有限公司)。

1.2小鼠平滑肌细胞的培养小鼠平滑肌细胞株MOVAS购自北京中原公司，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养于37 ℃、5% CO2常规条件下。

1.3细胞分组MOVAS细胞分为4组:对照组，不接受任何药物处理；35 μmol/L t-BHP组采用35 μmol/L t-BHP以诱导氧化应激；35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组，在t-BHP处理细胞的同时加入1 mmol/L NAC；1 mmol/L NAC组，仅使用1 mmol/L NAC处理细胞。处理时间均为24 h。

1.4DCFH-DA探针检测各组细胞内的ROS水平各组细胞完成处理后，加入含10 μmol/L DCFH-DA探针的无血清DMEM培养基，避光37 ℃ 孵育0.5 h。调整细胞浓度为1×105/mL，荧光分光光度计检测细胞内荧光水平，激发波长设为485 nm 发射波长设为533 nm。ROS水平以荧光强度表示。

1.5CCK-8法计算各组细胞的存活率各组细胞完成处理后，每孔加入10 μL CCK试剂，继续培养4 h。摇床震荡10 min。 酶标仪分析各组450 nm处的吸光度，计算公式：细胞抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%，计算各组细胞抑制率。

1.6实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测各组细胞SMA、SMemb及miR-145 的mRNA 表达细胞处理后，使用ImProm-Ⅱ®反转录试剂盒对提取出的RNA进行反转录，以合成cDNA。反转录体系参照试剂盒提供的说明书。使用GO Taq®qPCR Master Mix试剂盒对上述合成的cDNA进行PCR扩增。SMA的上游引物序列为5′CCTATCTATGAGGGCTATGCC 3′,下游引物序列为5′TTCGTAGCTCTTCTCCAGGGA3′；SMemb引物上游序列为5′AGAGAGACCTGCCAATCCC 3′,下游引物序列为5′TTCCAAAGCTCAGCCACAAA 3′；β-actin的上游引物为5′TGCTGT CCCTGTATGCCTCT3′,下游引物为5′TTGATGTCACGCACGATTTC3′。miR-145上游引物序列为5′ATTATATTGTCCAGTTTTCCCAGG 3′，下游引物序列为5′AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCTC 3′；miRNA-145的检测使用U6 snRNA为内参，其上游引物为5′ATTGGAACGATACAGAGAAGATT3 ′，下游引物为5′GGAACGCTTCACGAATTTG3′。反应体系和方案参照试剂盒说明书。使用2-△△CT法分析各样本的相对表达情况。

1.7Western blot 检测各组细胞SMA、SMemb的蛋白表达各组细胞处理后，使用含1%蛋白抑制剂的放射免疫分析裂解液裂解细胞，提取蛋白。蛋白提取液与上样缓冲液混匀后煮沸5 min，每孔上样量均为40 μg。12%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳完成后，用聚偏二氟乙烯膜电转条带。5%脱脂奶粉室温封闭膜1 h。分别使用兔抗小鼠β-actin多克隆抗体、兔抗小鼠SMA多克隆抗体、兔抗小鼠SMemb多克隆抗体4 ℃结合过夜。电化学发光显色试剂盒显色，分析蛋白条带。

2结果

2.1各组细胞经过处理后的ROS水平变化4组间ROS水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。组间两两比较结果显示，35 μmol/L t-BHP组和35 μmol/L t-BHP+1mmol/L NAC组荧光强度高于对照组(P<0.05)，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组和1 mmol/L NAC组荧光强度低于35 μmol/L t-BHP组(P<0.05)，与1 mmol/L NAC组相比，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组荧光强度较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2NAC和t-BHP处理对MOVA细胞增殖率的影响4组间MOVA细胞增殖率比较差异有统计学意义(P<0.05)。组间两两比较结果显示，35 μmol/L t-BHP组和35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组细胞增殖率高于对照组(P<0.05)，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组和1 mmol/L NAC组细胞增殖率低于35 μmol/L t-BHP组(P<0.05)，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组细胞增殖率低于1 mmol/L NAC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3NAC和t-BHP处理对MOVA细胞表型的影响各组间SMA的mRNA和SMemb的mRNA表达比较差异有统计学意义(P<0.05)。组间两两比较结果显示，35 μmol/L t-BHP组和35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组SMA的mRNA、SMemb的mRNA表达水平高于对照组(P<0.05)，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组和1 mmol/L NAC组SMA的mRNA、SMemb的mRNA表达水平低于35 μmol/L t-BHP组(P<0.05)，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组和1 mmol/L NAC组比较，SMA的mRNA表达较低，Smemb的mRNA表达较高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。Western blot 分析各组SMA、SMemb的蛋白表达结果与mRNA表达结果一致，35 μmol/L t-BHP组和35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组SMA的mRNA、SMemb的蛋白表达水平高于对照组，1 mmol/L NAC组与对照组比较，SMA及Smemb 蛋白表达强度类似,35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组和1 mmol/L NAC组SMA及SMemb的蛋白表达水平低于35 μmol/L t-BHP组，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组和1 mmol/L NAC组比较，SMA的蛋白表达较低，Smemb的蛋白表达较高，见图1。

图1　各组细胞SMA和Smemb的蛋白表达条带　SMA：平滑肌α-肌动蛋白；SMemb:平滑肌胚胎型肌球蛋白重链

2.4NAC和t-BHP处理会对MOVA细胞miR-145表达的影响各组间miR-145的表达比较差异有统计学意义(P<0.05)。35 μmol/L t-BHP组和35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组miR-145表达低于对照组，1 mmol/L NAC组miR-145表达高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组和1 mmol/L NAC组miR-145表达高于35 μmol/L t-BHP组(P<0.05)，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC组和1 mmol/L NAC组比较，miR-145明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1NAC和t-BHP处理对ROS及MOVA细胞增殖率、细胞表型及miR-145表达的影响

组 别ROS水平MOVA增殖抑制(%)SMAmRNA表达SMembmRNA表达miR-145表达对照组30±30.0±0.01.00±0.011.00±0.011.00±0.0135μmol/Lt-BHP组60±4a53.6±5.6a0.61±0.03a1.59±0.02a0.55±0.03a35μmol/Lt-BHP+1mmol/LNAC组46±4ab30.2±3.9ab0.75±0.02ab1.32±0.01ab0.79±0.04ab1mmol/LNAC组33±5bc5.6±0.3bc0.92±0.02bc0.95±0.02bc1.41±0.02abcF12.6318.44218.50911.41315.287P0.0000.0000.0000.0000.000

NAC：N-乙酰半胱氨酸；t-BHP:叔丁基氢过氧化物；ROS：活性氧类；SMA：平滑肌α-肌动蛋白；SMemb:平滑肌胚胎型肌球蛋白重链；a与对照组比较，P<0.05;b与35 μmol/L t-BHP组比较，P<0.05;c与35 μmol/L t-BHP+1mmol/L NAC组比较，P<0.05

3讨论

As的发生与氧化应激有密切的关系。氧化应激可以损伤VSMC，介导As从脂纹、脂斑形成到斑块破裂的整个病程[5-6]。但是氧化应激损伤VSMC的机制较为复杂，大部分研究认为氧化应激主要引起VSMC的凋亡，造成血管结构破坏[7]。但是氧化应激对VSMC的表型影响还尚未有研究证实。As发生的不同时期，VSMC增殖/凋亡失衡的表现不同，除VSMC增殖与As有关外，VSMC的表型变化也是As发生的重要环节，VSMC表型向合成型转换后，其收缩功能消失，而分泌功能增强,迁移至内膜下间隙大量增殖也是As发生的重要因素[6]。本研究结果显示，使用t-BHP诱发氧化应激后，MOVA细胞的收缩型标志物SMA表达降低，而合成型标志物SMemb表达增高，提示氧化应激确实可以造成VSMC的表型转换。从这个角度考虑，逆转VSMC的表型转变也许可以作为预防氧化应激引起As的思路。本研究使用NAC处理t-BHP 暴露后的MOVA细胞后，细胞增殖抑制程度缓解，凋亡率下降，同时NAC处理后，相比单纯t-BHP暴露的MOVA细胞，收缩型标志物SMA表达增多，合成型标志物SMemb降低，提示NAC可以缓解t-BHP引起的氧化损伤，同时还能防止MOVA细胞的表型转化。NAC是一种抗氧化剂，可以通过维持谷胱甘肽的浓度来对抗H2O2、自由基、脂质过氧化物等物质引起的氧化应激[8]。但是NAC通过何种机制发挥保护作用，还有待解释，因此本研究进一步考察了miR-145在NAC处理过程中的表达变化。miR-145是miRNA的一种，后者是真核生物中广泛存在的一种长为21～23个核苷酸的RNA分子，可调节多种基因的表达，进而影响细胞的分化、凋亡等活动[9]。miR-145是血管平滑肌表型调节过程中的关键因子,而表型调节过程是多种血管性疾病的共同病理过程[10]。本研究结果显示，t-BHP处理可以降低miR-145的表达，NAC处理可以提高miR-145的表达，因此可以假设NAC的保护作用还与miR-145的表达有关。

但目前还少有研究阐明miR-145的调控机制，有待于进一步研究。未来可借助慢病毒载体转染miR-145来进一步解释NAC保护VSMC的机制。

参考文献

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N-acetyl Cysteine′s Role in Attenuating Injury and Phenotype Change of Vascular Smooth Muscle Cells Induced by Oxidative StressFANMing-qiang,ZHANGYan-lin,DINGTao,WANGYing.(DepartmentofCardiology，PingliangCityPeople′sHospital，Pingliang744000,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the role of N-acetyl cysteine(NAC) in attenuating injury and phenotype shift of vascular smooth muscle cells(VSMC) induced by oxidative stress.MethodsMouse VSMCs(MOVAS cells) were divided into four groups after routine culture,including 35 μmol/L t-BHP treated group,35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC treated groups and 1 mmol/L NAC treated group,and control group.Intracellular ROS level in each group was detected by DCFH-DA probe.CCK-8 assay was used to detect the inhibition rate of each group.mRNA expression level of SMemb and SMA in MOVAS cells were analyzed by real-time quantitative PCR,protein expression level of SMemb and SMA were measured by Western blot.The effects of NAC and t-BHP on the expression of miR-145 was analyzed as well.ResultsAfter treatment with 35 μmol/L t-BHP,the intracellular level of ROS increased significantly,compared with the control group,the difference was significant(P<0.05).Compared with 35 μmol/L t-BH group,in 35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC group,the intracellular ROS level was lower (P<0.05).After the treatment of 35 μmol/L t-BHP,cell inhibition rate,apoptosis rate were increased,compared with the control group,the difference was significant(P<0.05).Compared with 35 μmol/L group t-BHP,in 35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC group,the cell inhibition rate and apoptosis were lower(P<0.05).Compared with control,the expression of SMA was decreased and the expression of Smemb was increased after 35 μmol/L t-BHP treatment,the difference was significant(P<0.05).Compared with 35 μmol/L t-BHP group,in 35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC group,the SMA expression was higher and the SMemb was lower(P<0.05).35 μmol/L t-BHP treatment can decrease the expression of miR-145,compared with the control group,the difference was significant (P<0.05).Compared with 35 μmol/L t-BHP group,in 35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC group,the miR-145 expression was higher(P<0.05).ConclusionOxidative stress induced VSMC damage and phenotype change can be attenuated by NAC,which involves the miR-145 expression increase.

Key words：N-acetyl cysteine; Vascular smooth muscle cell; Oxidative stress; MicroRNA

收稿日期：2014-10-20修回日期：2015-03-13编辑：伊姗

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.19.048

中图分类号：R365

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)19-3589-03