利奈唑胺对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌生物膜的抑制与消除活性及体内外抗菌活性研究

靳 悦，陈向东，汪 辉，姜剑伟，王岩岩，范 璐，李 魁，王素霞

中国药科大学 生命科学与技术学院微生物教研室，南京 210009

利奈唑胺对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌生物膜的抑制与消除活性及体内外抗菌活性研究

靳 悦，陈向东*，汪 辉，姜剑伟，王岩岩，范 璐，李 魁，王素霞

中国药科大学 生命科学与技术学院微生物教研室，南京 210009

目的：系统性评价利奈唑胺对2013~2014年耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）临床分离株细菌生物膜 （BBF）的活性及体内外抗菌效果。方法：体外试验测定最低抑菌浓度（MIC）；最低杀菌浓度（MBC）；最小抑制BBF浓度（MBIC）和最低BBF消除浓度（MBEC）；活菌计数法绘制时间-杀菌曲线（KCs）；体内试验采用小鼠MRSA全身感染模型，尾静脉给药保护小鼠后测定半数有效剂量（ED50）；建立免疫低下小鼠MRSA大腿感染模型，记录尾静脉给药24 h后大腿组织菌量的变化。结果：利奈唑胺对2013~2014年临床分离的60株MRSA均敏感；对金黄色葡萄球菌BBF的MBIC值与万古霉素相当，敏感性显著高于阿莫西林；体内试验中，利奈唑胺对全身感染小鼠有很好的治疗效果，ED50小于万古霉素与阿莫西林；对免疫低下MRSA大腿感染模型小鼠的保护作用也要优于万古霉素和阿莫西林。结论：利奈唑胺对2013~2014年分离的MRSA临床菌株体内外活性均较高，尤其对MRSA的细菌生物膜也显示了极强的抑制作用。

利奈唑胺；最小抑制细菌生物膜浓度；最低细菌生物膜消除浓度；半数有效剂量

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resis-tant Staphylococcus aureus，MRSA）是近年来引起院内感染的主要病原菌，随着抗生素的广泛使用，金黄色葡萄球菌的多药耐药株在逐年增加[2]，其可导致复杂性的皮肤软组织感染、重型肺炎、感染性心内膜炎及血液感染等，并且金葡菌极易形成细菌生物膜（bacterial biofilm，BBF），而BBF的产生加重了细菌的致病力与耐药性，这就更增加了金葡菌感染的治疗难度[1]。利奈唑胺属于全合成的噁唑烷酮类抗菌药物，自2007年国内上市以来已经成为临床上治疗MRSA感染的一线药品[2]。众多相关研究表明，利奈唑胺对金黄色葡萄球悬浮菌敏感性较高，但对金葡菌BBF的抑制和消除活性的研究少见报道。为了系统性评价利奈唑胺对新分离的60株MRSA的MBIC和MBEC，做了一系列实验研究，现报道如下。

1 材 料

1.1 药品与试剂

利奈唑胺注射液（Linezolid，Pfizer公司）；万古霉素（Vancomycin，Eli Lilly Japan K．K，公司）；阿莫西林钠（Amoxicillin，先声药业）；莫西沙星（Moxi-floxacin，拜耳药业）；乳酸环丙沙星氯化钠注射液（Ciprofloxacin，拜耳药业）。

MH肉汤、MH琼脂培养基和甘露醇氯化钠琼脂培养基（北京三药科技开发公司）。

1.2 菌株

MRSA为2013～2014年临床分离致病菌 （由广东省人民医院惠赠），共60株。质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC29213，金黄色葡萄球菌ATCC43300，于中国药科大学微生物学教研室保存。

1.3 动物

SPF级ICR小鼠，体重18～22 g，雌雄各半，各150只，合格证号：SCXK（沪）2013-0016，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。

2 方 法

2.1 利奈唑胺体外对MRSA悬浮菌的杀菌活性

采用CLSI推荐的琼脂平板稀释法。将药物稀释至平板浓度0．03～128 μg·mL-1，60株受试菌MR-SA菌悬液采用多点接种仪定量接种至MH平板，每点含菌105CFU，37℃恒温培养箱中培养18～20 h，观察结果。挑选MRSA菌株10株，分别接种含受试药物浓度为MIC的1～32倍的MH肉汤管，菌液的终浓度为5×105CFU·mL-1，37℃恒温培养24 h，取肉眼观察未见细菌生长管中的培养液0．1 mL，加到MH琼脂平板培养基中，37℃恒温培养18 h，菌落数小于5个/皿的药物最低浓度即为MBC。

2.2 利奈唑胺体外对MRSA的BBF抑制和消除活性

采用MH琼脂平板法测定利奈唑胺、万古霉素、阿莫西林对5株产BBF的MRSA的最小抑制BBF浓度（MBIC）和最低BBF消除浓度（MBEC）。用刚果红实验及结晶紫染色检查法选取5株产BBF的MRSA，将5株产BBF的MRSA于96孔板中37℃培养24 h，弃去形成BBF的96孔板中的悬液，用PBS缓冲液洗涤，药物分别2倍连续稀释为1～1024 μg·mL-1的溶液，取200 μL各浓度药物按顺序加入各孔。37℃培养24 h。弃去悬液，每孔中加入250 μL PBS缓冲液，于50 Hz下超声振荡30 min，在每孔中取10 μL涂布于MH琼脂平板上，37℃培养24 h。肉眼观察与对照孔（PBS孔）一样的最低药物浓度即为MBIC，平板上未见细菌生长的最低药物浓度即为MBEC[3]。

2.3 体外时间—杀菌曲线（KCs）测定

选择敏感MRSA菌株1株，于MH肉汤培养基中加入利奈唑胺、万古霉素、阿莫西林，使抗菌药物终浓度为（2、4、8、16、32）×MIC，加入菌悬液使菌液终浓度约为5×105CFU·mL-1，37℃恒温培养，分别于0、2、4、6、8、10、24 h取样进行活菌计数，以时间为横坐标，菌数对数为纵坐标绘制杀菌曲线。

2.4 利奈唑胺、万古霉素、阿莫西林对全身感染模型小鼠的治疗

挑取MRSA菌落接种于MH肉汤中，37℃、150r· min-1振荡培养8～10 h，4℃离心10 min弃上清液，无菌生理盐水重悬菌体。用5%的胃膜素[4]溶液将试验菌悬液稀释成一系列浓度，通过腹腔注射感染小鼠每只0．5 mL构建全身感染模型，测出试验菌株的最小致死量（MLD）。将利奈唑胺、万古霉素、阿莫西林分设5个剂量组及MLD空白对照组（不给药），剂量组小鼠在MLD菌液浓度下感染后，即刻与6 h后分别尾静脉注射给药，0．2 mL/鼠。给药后连续观察7 d，每天记录小鼠存活只数，计算利奈唑胺、万古霉素、阿莫西林对试验菌株的ED50及95%可信区间。

2.5 利奈唑胺、万古霉素、阿莫西林对大腿感染免疫低下小鼠的治疗

试验前1 d、4 d分别给予小鼠腹腔注射环磷酰胺生理盐水溶液100 mg·kg-1和150 mg·kg-1，注射量为0．2 mL，制备免疫低下模型小鼠。空白对照组在相应的时间，腹腔注射同体积的生理盐水。最后一次注射环磷酰胺后1 d，将试验菌MRSA稀释成系列浓度，免疫低下小鼠分为A、B、C、D 4组，于各组小鼠双侧大腿处分别接种原菌液，10倍、100倍、1000倍稀释菌液，每侧0．1 mL，空白对照组小鼠接种等量100倍稀释菌液。于接种2 h后，取各感染组及空白对照组小鼠2只处死，于无菌操作台中分离双侧大腿肌肉，称重、匀浆，进行活菌计数，37℃恒温培养12～18 h。大腿肌肉感染26 h后，将剩余小鼠全部处死，取大腿组织称重、匀浆，用甘露醇氯化钠培养基进行活菌计数，测出感染菌量[4]。将利奈唑胺、万古霉素、阿莫西林分为高（40 mg·kg-1）、中（20 mg· kg-1）和低（5 mg·kg-1）三个剂量组及阴性对照组，在小鼠两侧大腿感染MRSA 2 h和8 h后，剂量组尾静脉注射不同浓度的各组药物0．2 mL/只，对照组给予相同体积的生理盐水，给药24 h后将小鼠全部处死，于无菌操作台中取各大腿肌肉组织称重、匀浆，进行活菌计数，采用SPSS16．0软件进行统计分析。

3 结 果

3.1 利奈唑胺体外对MRSA悬浮菌的活性结果

MIC的测定结果如表1所示。利奈唑胺对2013～2014年广东省人民医院临床分离的60株MRSA均敏感，与万古霉素相当，显著高于莫西沙星、阿莫西林、环丙沙星，说明利奈唑胺对多药耐药的MRSA仍有较高的抑菌活性，且不易与其他类型的抗菌药物产生交叉耐药。最低杀菌浓度MBC的测定结果如表2所示。阿莫西林的MBC90/MIC90是利奈唑胺的2倍；利奈唑胺的MBC90/MIC90为16，说明其杀菌效果不强。

表1 利奈唑胺、万古霉素、莫西沙星、阿莫西林和环丙沙星对60株MRSA的MICR、MIC50、MIC90（mg·L-1）

3.2 利奈唑胺体外对MRSA的BBF抑制和消除活性结果

利奈唑胺对MRSA的BBF的抑制作用结果如表3所示。利奈唑胺对5株耐药菌的MBIC范围在2～4 mg·L-1，万古霉素MBIC也在2～4 mg·L-1，阿莫西林MBIC显著高于利奈唑胺。利奈唑胺MBEC在128～256 mg·L-1，MBEC是MBIC的若干倍。

表2 利奈唑胺、万古霉素、莫西沙星对20株MRSA的MBCR、MBC90（mg·L-1）、MBC90/MIC90

表3 利奈唑胺、万古霉素、阿莫西林对MRSA BBF的抑制和消除活性（mg·L-1）

3.3 体外时间-杀菌曲线（KCS）测定的结果

体外时间-杀菌曲线（KCS）的测定结果如图1所示。利奈唑胺在5～24 h内可达到99．9%的抑菌效果，万古霉素在8～24 h内对MRSA的抑制率达99．9%，两药对MRSA的时间-杀菌曲线相似，均好于阿莫西林。当利奈唑胺和万古霉素的药物浓度≥MBC时，抑菌的作用受浓度影响较小，说明利奈唑胺与万古霉素均为时间依赖型药物。

图1 利奈唑胺（A）、万古霉素（B）、阿莫西林（C）对MRSA的杀菌曲线

3.4 MRSA全身感染模型小鼠的治疗

利奈唑胺对MRSA全身感染模型小鼠的治疗效果如表4所示。利奈唑胺对全身感染模型小鼠有很强的保护作用，ED50为3．37mg/kg，优于对照药万古霉素5．26 mg·kg-1，阿莫西林的ED50为26．94 mg· kg-1，显著高于利奈唑胺。

3.5 MRSA大腿感染免疫低下小鼠的治疗

免疫低下小鼠大腿内侧肌肉处接种菌量为6．3×105CFU，接种2 h后，将其处死，大腿肌肉匀浆菌落计数为（9．64±0．82）×105CFU·g-1。利奈唑胺各药物浓度对大腿感染模型小鼠均有良好的治疗作用，高、中、低剂量组菌落数与不给药物治疗的阴性对照组比较有极显著性差异（P＜0．01）；随着药物剂量由低到高的增加，治疗效果显著加强。利奈唑胺低浓度剂量组菌落数与万古霉素低剂量组比较差异显著（P＜0．05），高、中剂量组菌落数两组比较无差异性（P＞0．05）；阿莫西林中、低剂量组菌落数与阴性对照组比较无差异性（P＞0．05）。由图2可以看出，利奈唑胺治疗小鼠MRSA大腿感染模型的效果略优于万古霉素，显著好于阿莫西林。

表4 利奈唑胺、万古霉素和阿莫西林对MRSA全身感染模型小鼠的ED50（mg·kg-1）

图2 利奈唑胺、万古霉素、阿莫西林不同药物浓度（5、20、40 mg·kg-1）对免疫低下小鼠大腿感染模型的治疗效果

4 讨 论

MRSA是临床常见的病原菌，可引起化脓性感染和院内感染，严重威胁着人类的健康，多药耐药菌株的出现和传播为金黄色葡萄球菌的临床治疗带来更大的难度[5]。此外，金黄色葡萄球菌易形成BBF，BBF的产生加强了细菌的致病性和耐药性，这就更加大了治疗的难度。利奈唑胺是一种全合成的噁唑烷酮类抗菌新药，临床上广泛用于治疗革兰阳性菌所致的感染[6]。研究报道，利奈唑胺作用于细菌核糖体50S大亚基的肽酰位，当细菌70S起始复合物未形成时，利奈唑胺与50S大亚基结合，导致其构型改变，与30S起始复合物的亲和力降低，则细菌不能形成70S起始复合物，翻译不能正常进行。在细菌正常的70S起始复合物中，氨酰t-RNA占据着50S亚基的肽酰位，即P位点，若利奈唑胺作用于细菌50S大亚基，药物就会占据P位点，在肽键形成时抑制肽键从A位到P位的易位,阻碍细菌蛋白质的合成。独特的作用机制使其不易与其他类型的抗菌药物产生交叉耐药[7]。

本实验中，利奈唑胺对2013～2014年临床分离的60株多药耐药MRSA悬浮菌均敏感，其MIC值介于0．25～2 mg·L-1，略低于万古霉素，显著低于莫西沙星、阿莫西林和环丙沙星，说明利奈唑胺对多药耐药的金黄色葡萄球菌仍有较高的活性，且不易产生交叉耐药。其对MRSA产生BBF的最小抑制浓度（MBIC）介于2～4 mg·L-1，与万古霉素相当，敏感性显著高于阿莫西林；最低BBF消除浓度（MBCE）在128～256 mg·L-1，是MBIC的若干倍。可见BBF一旦形成，则利奈唑胺也很难将其完全清除。体内试验结果显示，对于MRSA全身感染的小鼠，利奈唑胺ED50为3．37 mg·kg-1，明显优于万古霉素5．26 mg· kg-1和阿莫西林26．94 mg·kg-1。利奈唑胺尾静脉注射给药后对感染模型鼠显示了较强的保护作用。

利奈唑胺在体内外均有显著的抗MRSA活性，尤其对BBF显示了极强的抑制作用，可作为临床治疗MRSA BBF感染的药物，并且临床可结合其MIC、MBC、MBIC、MBEC及杀菌曲线、ED50等参数，设计更为合理的给药方案，以延长利奈唑胺的“使用周期”。

[1]Niederman MS,Chastre J,Solem CT,et al．Health e-conomic evaluation of patients treated for nosocomial pneumonia caused by methicillin-resistant Staphylococ-cus aureus:secondary analysis of a multicenter ran-domized clinical trial of vancomycin and linezolid[J]．Clin Ther,2014,36(9):1233-43．

[2]Bhan U,Podsiad AB,Kovach MA,et al．Linezolid has unique immunomodulatory effects in post-influenza community acquired MRSA pneumonia[J]．PLoS One, 2015,10(1):e0114574．

[3]申凤鸽．甘草查耳酮A抗金黄色葡萄球菌生物被膜的分子机制初步研究[D]．吉林大学，2013．

[4]张序磊，陈向东，高 聪，等．新截短侧耳素类化合物S3对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性研究 [J]．药物生物技术，2013，20（6）：510-3．

[5]WunderinkRG,NiedermanMS,KollefMH,etal．Linezolid in methicillin-resistant Staphylococcus aureus nosocomial pneumonia:a randomized,controlled study [J]．Clin Infect Dis,2012,54(5):621-9．

[6]Matsumoto K,Shigemi A,Takeshita A,et al．Analysis of thrombocytopenic effects and population pharmacoki-netics of linezolid:a dosage strategy according to the trough concentration target and renal function in adult patients[J]．Int J Antimicrob Agents,2014,44(3):242-7．

[7]辛小娟，黄文祥，李佳俊．利奈唑胺及其耐药机制研究[J]．中国抗生素杂志，2013，38（6）：411-4．

Activity of Linezolid against Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Biofilm and Its Antimicrobial Activity in Vitro and in Vivo

JIN Yue,CHEN Xiang-dong*,WANG Hui,JIANG Jian-wei,WANG Yan-yan,FAN Lu,LI Kui,WANG Su-xia
Department of Microbiology,School of Life Science and Technology,China Pharmaceutical University,Nan-jing 210009

Objective:To systematically research the antimicrobialactivity ofLinezolid against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)from 2013～2014 in vitro and in vivo．Methods:Minimal inhibitory concentration(MIC),minimal bactericidal concentration(MBC),minimal bacterial biofilm inhibitory concentration (MBIC)and minimal bacterial biofilm eradication concentration (MBEC)were determined in vitro．The time-killing curves (KCs)were drawn by live bacteria counting method．In vivo tests,the model of systemic infection with MRSA was established in mice,the mice were treated with linezolid by intravenous injection for the calculation of ED50．With the established immunodeficiency mouse model of thigh infection with MRSA,CFU in the thighs were counted 24 hours after the administration of linezolid by intravenous injection．Results:Linezolid was sensitive to all 60 clinically isolated MRSA．The MBIC of linezolid against MRSA bacterial biofilm were similar to those of Vancomycin,its sensitivity was significantly higher than that of Amoxicillin．In vivo,linezolid had better effects against systemic MRSA infection and thigh muscle MRSA infection compared with those ofVancomycin and Amoxicillin．Conclusion:Linezolid has excellent antibacterial activity against MRSA in vitro and in vivo．

Linezolid;Minimal bacterial biofilm inhibitory concentration;Minimal bacterial biofilm eradication concentration;Median effective dose

R915

A

1673-7806（2015）03-242-04

靳悦，女，硕士生 E-mail:njjinyue@126.com

*通讯作者陈向东，女，副教授 E-mail:chenxd_xj@163.com

2015-04-02

2015-05-12