加味藿香正气软胶囊对细菌性肠炎炎性因子的影响*

宗绍波，吕耀中，孙 兰，李卓琼，周 军，毕宇安，王振中，萧 伟**

1江苏康缘药业股份有限公司；2中药制药过程新技术国家重点实验室，连云港 222001

加味藿香正气软胶囊对细菌性肠炎炎性因子的影响*

宗绍波1，2，吕耀中1，2，孙 兰1，2，李卓琼1，2，周 军1，2，毕宇安1，2，王振中1，2，萧 伟1，2**

1江苏康缘药业股份有限公司；2中药制药过程新技术国家重点实验室，连云港 222001

目的：观察加味藿香正气软胶囊对细菌性肠炎大鼠炎症细胞因子的影响，探讨加味藿香正气软胶囊治疗细菌性肠炎的免疫机制。方法：70只大鼠随机分为正常组、模型组、藿香正气软胶囊组（0.324 g·kg-1）、柳氮磺吡啶肠溶片组（0.225 g·kg-1）、加味藿香正气软胶囊高、中、低剂量组（4.66、2.33、1.16 g·kg-1），除正常组外，其他各组采用细菌菌株法复制细菌性肠炎模型。各治疗组于第3次注射后，连续灌胃给药2周，放射免疫测定法检测各组大鼠血清中IL-1β、IL-10和TNF-α含量。结果：与正常组比较，模型组大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量均显著升高（P< 0.01），IL-10含量显著降低（P<0.01）；与模型组相比较，除加味藿香正气软胶囊低剂量组外，其它各组大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量均显著降低 （P<0.01或P<0.05）；柳氮磺吡啶肠溶片组（LDH）、加味藿香正气软胶囊高剂量组（JWG）、加味藿香正气软胶囊中剂量组（JWZ）大鼠血清中IL-10含量均显著增加（P<0.05，P<0.05，P<0.01）。结论：加味藿香正气软胶囊对细菌性肠炎具有治疗作用，其机制可能与IL-10、IL-1β和TNF-α等细胞因子水平调节相关。

加味藿香正气软胶囊；炎症性肠炎；细胞因子

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和Crohn’s病（Crohn’s disease，CD），是一种尚未完全明确，一般认为慢性肠道炎症性疾病。现在普遍认为发病机制涉及遗传易感性、环境因素、免疫异常、肠道菌群改变等多个方面，其中免疫失衡或者异常对慢性炎症至关重要[1]。现代免疫学研究表明，细胞因子平衡失调所致的免疫异常是IBD的重要发病机制[2]。加味藿香正气软胶囊源自《太平惠民和剂局方》中的藿香正气散，主要由藿香、厚朴和茯苓等13味中药组成[3]，并增加生姜和大枣两味中药用于调和脾胃，具有解表化湿、理气和中的功效，目前被临床广泛用于急慢性肠炎的治疗。因此本实验采用大鼠结肠细菌菌株法复制IBD大鼠模型，考察加味藿香正气软胶囊对大鼠血清中细胞因子含量的影响，从而探讨加味藿香正气软胶囊对细菌性肠炎的免疫系统的影响，为其机制研究和临床用药提供依据。

1 材 料

1.1 仪器

CENTRFUGE5840型冷冻离心机（eppendorf）；nfinite M200Pro酶标仪 （TECAN公司）；r-911全自动放免计数仪（中国科技大学实业总公司）；立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限医疗设备厂）；恒温培养振荡器（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 药物

加味藿香正气软胶囊（江苏康缘药业股份有限公司，规格：0.6 g/粒，相当于饮片2.157 g，批号：130705）；柳氮磺吡啶肠溶片（上海福达制药有限公司，规格：0.25 g/片，批号：22130809）；藿香正气软胶囊 （神威药业有限公司，规格：0.45 g/粒，批号：12032231）。

1.3 试剂

IL-1β放免药盒 （批号HY-10101）、TNF-α放免药盒 （批号HY-10116），IL-10放免药盒 （批号HY-10107），北京华英生物技术研究所；MH营养肉汤培养基（规格：100 g/瓶，批号：201111072），MH琼脂（规格：100 g/瓶，批号：201006081），广东环凯生物科技有限公司。

1.4 动物

SD大鼠，SPF级，雄性，体重160～180 g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号：SCXK（沪）2013-0016。

大肠杆菌（连云港第一人民医院检验科提供）。

2 方 法

将大肠杆菌分别用营养肉汤在37℃、130 r· min-1培养箱中振荡培养18 h，在600 nm酶标仪测量吸光度，根据公式：菌液浓度=吸光度（OD值）×6× 109×稀释倍数。调整菌液的浓度至1×109个/mL，菌液在接种前新鲜配制。

随机选取10只大鼠为正常组，其它大鼠依据参考文献[4]分别于第1、10、17、24天共接受4次免疫。第1天于每只大鼠后足跖处注射大肠杆菌细菌抗原物质0．2 mL；第10天、第17天分别于每只大鼠腹部和背部皮下多点注射0．4 mL和0．6 mL；第24天于每只大鼠腹腔内注射1．2 mL。动物在第2次免疫前每只大鼠灌胃给予新鲜配制的大肠杆菌细菌悬液1．5 mL（浓度同前），于第3次注射细菌悬液前随机分为6组，分别为模型组、柳氮磺吡啶肠溶片组（0．225 g·kg-1，LDH）、藿香正气软胶囊组（0．324 g内容物/kg，HX）、加味藿香正气软胶囊高剂量组（4．66 g生药/kg，JWG）、加味藿香正气软胶囊中剂量组（2．33 g生药/kg，JWZ）、加味藿香正气软胶囊低剂量组（1．16 g生药/kg，JWD），每组10只大鼠。正常组和模型组灌胃给予0．5%CMC-Na混悬液；其他组给予相应的药物，给药体积为10 mL·kg-1；每天1次，连续14 d。各组大鼠末次灌胃24 h后取材检测，前一天禁食不禁水12 h，10%水合氯醛麻醉动物，腹主动脉采血5 mL于未加抗凝剂试管中，3000 r·min-1离心10 min，取上层血清保存备用。按照试剂盒说明书检测IL-1β、IL-10、TNF-α含量。

3 结 果

3.1 对模型大鼠血清中IL-1β含量的影响

实验结果表明（见图1），与正常组比较，模型组大鼠血清中IL-1β含量显著升高（P＜0．01）；与模型组比较，LDH组、HX组、JWG组、JWZ组大鼠血清中IL-1β含量均显著降低（P＜0．01，P＜0．05，P＜0．01，P＜0．05）。与JWD组无显著性差异。

3.2 对模型大鼠血清中TNF-α含量的影响

实验结果表明（见图2），与正常组比较，模型组大鼠血清中TNF-α含量显著升高（P＜0．01）；与模型组比较，LDH组、HX组、JWG组、JWZ组大鼠血清中 TNF-α含量均显著降低 （P＜0．01，P＜0．01，P＜0．01，P＜0．05），与JWD组无显著性差异。

3.3 对模型大鼠血清中IL-10含量的影响

实验结果表明（见图3），与正常组相比较，模型组大鼠血清中IL-10含量显著下降（P＜0．01）；与模型组比较，LDH组、JWG组、JWZ组大鼠血清中IL-10含量均显著增加（P＜0．05，P＜0．05，P＜0．01），其他各组均无显著性差异。

图3 各组大鼠血清IL-10含量

4 讨 论

大量研究表明，肠道共生菌落和肠道黏膜免疫系统之间的平衡紊乱是IBD发生的重要诱因[5]。肠道内菌群失调往往伴随着黏膜屏障功能损伤及其免疫调节异常，大量肠道内共生菌落抗原可以特异性激活肠道黏膜内淋巴细胞，并诱导其增殖分化，表现为无节制的免疫反应和免疫失调的免疫学特性[6]。本实验采用大鼠结肠细菌菌株法复制IBD大鼠模型，通过注射细菌抗原物质结合灌服大肠杆菌细菌悬液，造成肠道菌群失调并激活肠黏膜的免疫系统，能较好的模拟临床症状，有助于阐明细胞免疫在IBD中的作用机制。

细胞因子作为细胞间的信号传递分子，在肠黏膜免疫调节和炎症反应过程中发挥重要作用。在临床慢性肠炎患者结肠黏膜中能够检测到大量的淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞，其均能释放大量的细胞因子。IL-1和TNF-α属于促炎细胞因子，主要由Th1细胞产生，参与细胞免疫反应，促进炎症反应；TNF-α能够诱导NO合成酶产生，而过量的NO损伤组织和细胞，介导肠道动脉充血等，损伤肠道黏膜屏障，加重炎症病变。大量研究发现，处于溃疡性结肠炎活动期的患者血浆中IL-1β和TNF-α含量均显著升高[7]。IL-10属于抗炎细胞因子，主要有Th2细胞产生，参与体液免疫反应，能够抑制Th1细胞功能，抑制炎症反应。本实验中，造模后大鼠血清中IL-1和TNF-α含量显著升高，IL-10含量显著降低；加味藿香正气软胶囊给药干预后，加味藿香正气软胶囊高、中剂量组大鼠血清中IL-1和TNF-α含量显著降低，而IL-10含量升高，表明能够同时调节促炎因子和抗炎因子的产生和释放，对免疫系统平衡状态的恢复具有调节作用，其改善作用与柳氮磺吡啶肠溶片相近；其次，实验结果表明，加味藿香正气软胶囊对抗炎因子IL-10含量上调作用优于藿香正气软胶囊。

综上所述，加味藿香正气软胶囊对促炎细胞因子和抗炎细胞因子均具有调节作用，能升高IL-10水平，降低IL-1β和TNF-α水平。因此我们认为加味藿香正气软胶囊可能是通过调节细胞因子体内的平衡及保护胃肠道黏膜而发挥治疗作用，但其调节和保护机制尚不明确，有待作进一步研究。

[1]刘占举．炎症性肠病发病机制新进展[J]．内科理论与实践，2013，8（1）：5-8．

[2]Papadakis KA,Targan SR．Role of cytokines in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J]．Annu Rev Med,2000,51(1):289-98．

[3]陆 茵，陈文星，孟政杰，等．加味藿香正气软胶囊调节胃肠运动功能的作用[J]．中药新药与临床药理，2003，14（6）：381-3．

[4] 田振国．通腑宁颗粒对免疫法复制大鼠UC动物模型影响的实验研究[J]．中华中医学刊，2007，25（7）：1325-6．

[5]Swidsinski A,Ladhoff A,Pernthaler A,et al．Mucosal flora in inflammatory bowel disease[J]．Gastroenterology, 2002,122(1):44-54．

[6]Ohkusa T,Nomura T,Sato N．The role of bacterial in-fection in the pathogenesis of inflammatory bowel dis-ease[J]．Intern Med,2004,43(7):534-9．

[7]Stevens C,Walz G,Singaram C,et al．Tumor necrosis factor-alpha,interleukin-1 beta,and interleukin-6 ex-pression in inflammatory bowel disease[J]．Dig Dis Sci, 1992,37(6):818-26．

Effect of Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule on Chemotactic Cytokine of Colitis in Rats*

ZONG Shao-bo1,2,LV Yao-zhong1,2,SUN Lan1,2,LI Zhuo-qiong1,2,ZHOU Jun1,2,BI Yu-an1,2, WANG Zhen-zhong1,2,XIAO Wei1,2**
1Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.,Ltd.;2State Key Laboratory of New Pharmaceutical Process for Tradi-tional Chinese Medicine,Lianyungang 222001

Objective:To probe the mechanism of Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule for treatment of colitis through observing inflammatory cytokine in serum．Methods:Seventy rats were randomly divided into seven groups,such as control group,model group,Sulfasalazine Enteric-coated Tablets group(0．225 g· kg-1),Huoxiang Zhengqi Soft Capsule group (0．324 g·kg-1)and three dosage groups of Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule (4．66 g·kg-1,2．33 g·kg-1,1．16 g·kg-1)．Except for the control group,the colitis model of rats was established with Colibacillus．After the third injection,the rats of the therapy groups were treated with indicated drugs by intragastric administration for two weeks．The levels of IL-1β,IL-10 and TNF-α in serum were measured by radioimmunoassay．Results:The levels of IL-1β and TNF-α in the model group were significantly higher than those in the normal group (P＜0．01),the level of IL-10 in the model group was significantly lower than that in the normal group (P＜0．01)．In comparison with the model group,the levels of IL-1β and TNF-α were significantly decreased except for rats in the lower dosage of Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule group (P＜0．01,P＜0．05),the levels of IL-10 in the Sulfsalazine En-teric-coated Tablets group,high and middle dosage of Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule groups were significantly increased (P＜0．05,P＜0．05,P＜0．01)．Conclusion:Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule can improve bacterial inflammatory bowel disease by regulating the levels of IL-1β,IL-10 and TNF-α in vivo．

Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule;Inflammatory bowel disease;Cytokine

R965

A

1673-7806（2015）03-229-03

国家国际合作专项（No.2013DFA31090）

宗绍波，男，硕士，从事药理学研究E-mail:zongshaobo1985@163.com

* *

萧伟，男，博士，研究员级高级工程师，研究方向：中药新药的研究与开发 E-mail:kanionlunwen@163.com

2014-12-01

2015-01-18